小串鏈霉菌XG40菌株發(fā)酵條件優(yōu)化及其次生代謝產(chǎn)物性質(zhì)研究

賴寶春，戴瑞卿，曾天寶，姚錦愛(ài)

（1.福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州 363005；2.福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013）

鏈霉菌是數(shù)量和種類(lèi)較多的一類(lèi)高等放線菌，能產(chǎn)生各種具有生物活性物質(zhì)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛分布于土壤和海洋中，在植物體內(nèi)、空氣中也能發(fā)現(xiàn)，在植物病害的防治中起到很重要的作用[1-4]。鏈霉菌的次生代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生多種抗生素，種類(lèi)繁多，在已發(fā)現(xiàn)具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物中占三分之一[5]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鏈霉菌的研究多集中在代謝產(chǎn)物方面，而發(fā)酵是鏈霉菌獲取大量有效活性物質(zhì)的必要途徑[6]。因此，在得到高效生防菌后，通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化是提高生防菌有效活性物質(zhì)產(chǎn)量不可或缺的一部分[7]，對(duì)植物病害的生物防治意義重大。大量研究表明，鏈霉菌發(fā)酵液通過(guò)優(yōu)化得到最適的發(fā)酵培養(yǎng)基及最佳的培養(yǎng)條件后抑菌活性顯著提高[8-10]。此外，生防制劑的研發(fā)除了考慮抗菌效果外，還要考慮其活性成分的穩(wěn)定性、生產(chǎn)和貯運(yùn)等問(wèn)題。

小串鏈霉菌XG40為本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離的一株優(yōu)良拮抗菌，其發(fā)酵液對(duì)蜜柚黑斑病菌、番茄葉霉病菌、蜜柚炭疽病菌等植物病原真菌具有明顯的抑制作用，且對(duì)植物病原細(xì)菌也有較好的抑制作用，盆栽試驗(yàn)及田間試驗(yàn)表明，小串鏈霉菌XG40對(duì)蜜柚黑斑病、蜜柚炭疽病、蜜柚黑點(diǎn)病均有較好的防控效果，其中對(duì)蜜柚黑斑病的防控效果最好[11,12]。前人對(duì)小串鏈霉菌的研究多集中在醫(yī)藥、生物及化學(xué)領(lǐng)域方面。許多研究報(bào)道，小串鏈霉菌能產(chǎn)生仲丁酸[13]、甘氨酸[14]、纖維抑制素[15-16]及生育酚[17]等次生代謝產(chǎn)物，還具有合成銀納米顆粒的潛力[18,19]。但在防治植物病害方面研究較少，國(guó)內(nèi)僅蔣常德等[20]報(bào)道將小串鏈霉菌與其它微生物制成復(fù)合微生物菌肥能防治小麥全蝕病。國(guó)外僅Hoda 等[21]報(bào)道從土壤中篩選到一株小串鏈霉菌具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)及耐受重金屬的能力，且在植株根際定殖能力強(qiáng)。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)小串鏈霉菌還能用于防治蟲(chóng)害，Soliman等[22]從小串鏈霉菌MY12的次生代謝產(chǎn)物中提取的純物質(zhì)能抑制大蠟螟幼蟲(chóng)發(fā)育、延長(zhǎng)幼蟲(chóng)化蛹期及減少成蟲(chóng)羽化率。因此，小串鏈霉菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，不同來(lái)源的小串鏈霉菌菌種其代謝產(chǎn)物也不盡相同。目前未見(jiàn)小串鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化及其活性物質(zhì)穩(wěn)定性的報(bào)道。小串鏈霉菌XG40發(fā)酵上清液中含有抗菌的活性物質(zhì)，為進(jìn)一步提高其活性物質(zhì)的產(chǎn)量，本研究通過(guò)對(duì)小串鏈霉菌XG40液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)提取物的活性成分穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，為后期小串鏈霉菌XG40規(guī)模化發(fā)酵、提純及制劑開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

小串鏈霉菌Streptomyces catenulaeXG40，琯溪蜜柚黑斑病菌（亞洲柑橘葉點(diǎn)霉Phyllosticta citriasiana），均由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所分離純化并保存。生物測(cè)定的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），高氏1號(hào)培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO4.7H2O 0.5 g、FeSO4.7H2O 0.01 g、水1000 mL，pH 7.0；碳、氮源按試驗(yàn)要求加入，上述培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌30 min，備用。

1.2 種子液的制備

將小串鏈霉菌XG40于高氏1號(hào)培養(yǎng)基均勻劃線后，28 ℃培養(yǎng)7 d至培養(yǎng)基表面出現(xiàn)淺紫羅蘭色孢子絲。挑取直徑為5 mm的菌餅5塊接入高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基（250 mL三角瓶裝液量50 mL），于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，即得種子液。然后以10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶裝液量100 mL），相同條件下培養(yǎng)7 d。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.3.1 碳源優(yōu)化 在發(fā)酵基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入10 g/L蛋白胨及50 g/L不同的碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和玉米粉），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌濃度及抑菌帶的大小。菌濃度的測(cè)定[23]：取10 mL發(fā)酵液，6000 r/min離心10 min，棄上清液稱濕菌體質(zhì)量，換算出1000 mL發(fā)酵液里所含的菌體濕質(zhì)量（g），用質(zhì)量濃度表示菌濃度（g/L）。抑菌帶的測(cè)定：采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[24]。將指示菌（琯溪蜜柚黑斑病菌）接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的中心，在距指示菌25 mm處的2個(gè)點(diǎn)打孔，然后在孔中加入200 μL的上清液，對(duì)照組中加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至打孔位置后測(cè)量抑菌帶寬。

1.3.2 氮源優(yōu)化 在發(fā)酵基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入已確定的合適碳源及10 g/L不同的氮源（蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、KNO3、(NH4)2SO4和 NH4Cl），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌濃度及抑菌帶寬。

1.3.3 正交試驗(yàn) 利用正交法[23]設(shè)計(jì)二因素四水平的正交試驗(yàn)，把已確定的合適碳源、氮源以濃度梯度分別加入到發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d，測(cè)定菌濃度及抑菌帶寬。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 初始pH值優(yōu)化 將發(fā)酵液的初始pH值分別調(diào)節(jié)為4.0～10.0，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，確定最適pH。

1.4.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化 將發(fā)酵液分別于22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)7 d，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.4.3 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化 將發(fā)酵液分別培養(yǎng)3～10 d，每天分別取樣，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.4.4 裝液量?jī)?yōu)化 在500 mL三角瓶中分別裝入50、75、100、125、150、175、200 mL的優(yōu)化培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，確定最適裝液量。

1.4.5 接種量?jī)?yōu)化 將種子液按3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接種量接入優(yōu)化后的培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，確定最適接種量。

1.4.6 轉(zhuǎn)速優(yōu)化 設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200、220、240 r/min，確定最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。以上每組處理重復(fù)3次。

1.5 粗提物的制備

選取乙酸乙酯作為提取溶劑，從小串鏈霉菌發(fā)酵液中提取活性物質(zhì)。將10 L無(wú)菌發(fā)酵液與10 L的提取溶劑混合，超聲波提取10 min，150 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，靜置12 h，使混合液分層，用分液漏斗收集提取后的有機(jī)相，在40 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至干燥，得到活性成分粗提物，稱重后用一定體積的甲醇溶解，稀釋成 10%、20%、30%、40%、50%的甲醇溶解液。以琯溪蜜柚黑斑病菌為指示菌測(cè)定其抑菌活性，測(cè)定方法同1.3.1。

1.6 活性物質(zhì)的穩(wěn)定性測(cè)定

1.6.1 酸堿穩(wěn)定性 將乙酸乙酯提取物稱重，稀釋成50%的甲醇溶解液，用于下列試驗(yàn)。調(diào)節(jié)pH值為4.0～10.0，4 ℃冰箱放置24 h后回調(diào)pH值為7.0，以未經(jīng)調(diào)節(jié)pH值的乙酸乙酯提取物溶液為對(duì)照。

1.6.2 熱穩(wěn)定性 將乙酸乙酯提取物溶液分別在50 ℃、60 ℃、70℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水浴鍋中處理1 h后放至室溫，以未經(jīng)熱處理的乙酸乙酯提取物溶液為對(duì)照。

1.6.3 光照穩(wěn)定性 將10 mL乙酸乙酯提取物溶液分別平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿（d=60 mm）底部，在30 W紫外燈下30 cm處分別照射3、6、9、12、15、18 h，以未經(jīng)照射的乙酸乙酯提取物溶液為對(duì)照。

1.6.4 貯存穩(wěn)定性 測(cè)定乙酸乙酯提取物在液體狀態(tài)下貯存抑菌活性的穩(wěn)定性。將乙酸乙酯提取物溶液分裝至滅菌的離心管中（5 mL大小，每管裝2 mL）。分別置于-20 ℃、4 ℃、20 ℃、28 ℃和37 ℃下存放，在放置0、15、30、60、120 d后，測(cè)定其抑菌活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Graphpad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

不同碳源處理的培養(yǎng)基中，玉米粉和葡萄糖有利于小串鏈霉菌XG40菌絲的生長(zhǎng)，菌濃度分別為126.59和101.97 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）；玉米粉作為碳源時(shí)的抑菌活性最大，抑菌帶寬為17.3 mm，顯著高于以葡萄糖作為碳源的處理（P＜0.05），更有利于小串鏈霉菌XG40代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)（表1）。因此，綜合抑菌活性、菌濃度、材料價(jià)格及來(lái)源考慮，選用玉米粉作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同碳源對(duì)小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.2 不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

表2結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40在6種不同的氮源培養(yǎng)基中發(fā)酵情況不同，有機(jī)氮源中酵母粉和黃豆粉發(fā)酵獲得的菌濃度較多，分別為166.12和191.03 g/L，但酵母粉和黃豆粉產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的量與菌絲體生長(zhǎng)量的變化不一致，抑菌帶寬分別為19.1和18.7 mm，顯著高于其他處理（P＜0.05）；小串鏈霉菌XG40在無(wú)機(jī)氮源中生長(zhǎng)及產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力均比有機(jī)氮源弱，不適合作為單獨(dú)的氮源使用（表2）。綜合考慮，選用酵母粉和黃豆粉作為最佳組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 不同氮源對(duì)小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.3 不同氮源比例對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

不同比例的黃豆粉和酵母粉替代初始培養(yǎng)基中的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)活性物質(zhì)的影響結(jié)果表明，隨著黃豆粉和酵母粉比例中黃豆粉比例的降低，菌絲體生長(zhǎng)量隨之減少。黃豆粉與酵母粉比例為3:2和2:3時(shí)抑菌活性最好，抑菌帶寬分別為19.7和19.6 mm，無(wú)顯著性差異（P＜0.05），但黃豆粉、酵母粉比例為3:2時(shí)菌濃度和抑菌活性稍優(yōu)于黃豆粉、酵母粉比例為2:3的組合（表3）。因此，選擇黃豆粉、酵母粉比例為3:2組合進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

表3 不同氮源比例對(duì)小串鏈霉菌XG40菌濃度及產(chǎn)活性物質(zhì)量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources rate on the accumulation of mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇玉米粉作為碳源，黃豆粉、酵母粉比例為3:2作為氮源組合，設(shè)計(jì)A、B兩因素四水平L16（42）的正交試驗(yàn)，因素水平和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4和表5。表5顯示編號(hào)10、11、12、14、15、16組合的試驗(yàn)結(jié)果較好，其中編號(hào)11（組合A3B3）組合的抑菌帶最大（21.7 mm），菌濃度高（223.28 g/L），說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)好。確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米粉50 g/L，黃豆粉9 g/L，酵母粉6 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基的L16(42) 正交試驗(yàn)因素和水平Table 4 The orthogonal experiment factors and level L16(42) of optimal medium

表5 小串鏈霉菌XG40發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of the orthogonal test with carbon sources and nitrogen sources in fermentation medium of S.catenulae XG40

2.5 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化

小串鏈霉菌XG40在發(fā)酵初始pH值小于或大于7.0時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)及抑菌活性均受到一定的影響，因此確定該菌株液體發(fā)酵的最適初始pH值為7.0（圖1A）。當(dāng)培養(yǎng)溫度在25 ℃～31 ℃時(shí)，均適合小串鏈霉菌XG40菌絲體生長(zhǎng)，當(dāng)溫度大于37 ℃時(shí)，不利于小串鏈霉菌XG40菌絲體生長(zhǎng)，菌濃度及抑菌帶寬均較?。▓D1B）。小串鏈霉菌XG40在發(fā)酵2 d菌絲體基本不生長(zhǎng)，也無(wú)活性物質(zhì)分泌；第3 d菌絲體少量生長(zhǎng)，有活性物質(zhì)產(chǎn)生；至第6 d菌絲體生長(zhǎng)量和活性物質(zhì)量均達(dá)到最高（P＜0.05），7 d后的菌絲體生長(zhǎng)量和活性物質(zhì)量稍微下降，但不明顯（圖1C）。在500 mL的三角瓶中，不同體積的發(fā)酵液造成的傳質(zhì)阻力及相對(duì)空氣量不同，當(dāng)500 mL三角瓶中的裝液量少于100 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，菌濃度和抑菌活性也逐漸增加；當(dāng)裝液量為100 mL時(shí)，既能保證小串鏈霉菌XG40菌絲生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又有利于活性物質(zhì)量的產(chǎn)生；當(dāng)裝液量大于100 mL時(shí)，表現(xiàn)出空氣量變小，氧氣傳質(zhì)阻力變大，不利于菌濃度和活性物質(zhì)的產(chǎn)生（圖 1D）。接種量對(duì)小串鏈霉菌 XG40菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)生活性物質(zhì)影響顯著，當(dāng)接種量為7%時(shí)，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為286.72 g/L和23.2 mm；隨著接種量的不斷增大，菌濃度開(kāi)始逐漸減少，當(dāng)裝液量大于15 %時(shí)，菌濃度和抑菌活性下降較快，可能是培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不能滿足菌絲體生長(zhǎng)的需要（圖1E）。當(dāng)轉(zhuǎn)速為120～160 r/min時(shí)，小串鏈霉菌XG40的菌濃度逐漸增加；以轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，菌濃度和抑菌帶寬最大，分別為295.39 g/L和23.3 mm（圖1F）。綜合上述菌濃度和抑菌帶寬2個(gè)指標(biāo)，確定小串鏈霉菌XG40液體發(fā)酵初始最適pH值為7.0，溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，裝液量100 mL/500 mL，接種量7%，轉(zhuǎn)速160 r/min。

圖1 不同發(fā)酵條件對(duì)小串鏈霉菌XG40菌濃度及活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on mycelium and antibacterial substance of S.catenulae XG40

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化前后效果對(duì)比

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基碳源、氮源及發(fā)酵條件優(yōu)化后的抑菌帶寬為23.3 mm，顯著高于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的抑菌帶寬16.8 mm（P＜0.05），抑菌活性提高了38.7%（圖2），表明發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化后更有利于小串鏈霉菌XG40代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)。

圖2 小串鏈霉菌XG40發(fā)酵培養(yǎng)基及條件優(yōu)化前后效果對(duì)比Fig.2 Comparison effects of S.catenulae XG40 fermentation broth before and after medium and conditions optimization

2.7 粗提物的抑菌活性測(cè)定

通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中粗提物的抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明，乙酸乙酯能把小串鏈霉菌XG40發(fā)酵液中的活性物質(zhì)很好地提取出來(lái)，該提取物稀釋為不同濃度的甲醇溶解液，對(duì)蜜柚黑斑病的抑菌作用差異顯著（P＜0.05），其中，稀釋為40%、50%甲醇溶解液的抑菌作用顯著高于其他濃度，并隨著活性物質(zhì)濃度的降低，抑菌作用顯著減弱（圖3和4）。

圖3 不同濃度活性物質(zhì)對(duì)黑斑病菌菌絲的抑菌效果Fig.3 Antifungal activity of active component concentration gradient against mycelial growth of P.citriasiana

圖4 活性物質(zhì)抑菌活性濃度梯度測(cè)定Fig.4 Determination of antifungal activity of active component concentration gradient

2.8 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

在酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)中，小串鏈霉菌XG40乙酸乙酯提取物分別在pH值為4～10的環(huán)境中能保持良好的抑菌活性，抑菌帶寬均為20.0 mm以上，在pH值為7處理后抑菌帶寬為24.2 mm，隨著酸性和堿性的增強(qiáng)，抑菌活性有所下降，但差異不顯著（P＜0.05）。在pH值為4和pH值為10的條件下抑菌帶寬分別為20.2和20.0 mm，說(shuō)明小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)對(duì)酸堿較穩(wěn)定（圖5A）。

在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中，50 ℃處理1 h后，乙酸乙酯提取物的抑菌活性沒(méi)有明顯下降。60 ℃處理1 h，抑菌活性有明顯的下降，抑菌帶寬為20.2 mm，與50 ℃的處理差異顯著（P＜0.05）。70 ℃處理1 h的抑菌帶寬下降至15.8 mm，顯著低于60 ℃的處理（P＜0.05）。80 ℃和100 ℃高溫處理1 h后幾乎失去抑菌活性。說(shuō)明小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)對(duì)60 ℃～70 ℃之間的溫度敏感，對(duì)70 ℃以上的高溫比較敏感（圖5B）。

在紫外線照射穩(wěn)定性試驗(yàn)中，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸乙酯提取物的抑菌活性下降明顯。在紫外線照射3 h，抑菌帶寬下降至22.8 mm，與對(duì)照相比差異顯著（P＜0.05）；照射12 h，抑菌帶寬下降至19.8 mm，顯著低于照射3 h的處理?；钚猿煞衷? h內(nèi)的紫外線照射表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有利于室外防治與應(yīng)用（圖5 C）。綜合上述結(jié)果表明，小串鏈霉菌XG40的活性物質(zhì)較耐酸堿和短時(shí)間的紫外線照射，對(duì)70 ℃以上的高溫比較敏感。

圖5 不同條件對(duì)活性成分抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different conditions on antifungal actvity of the active component of S.catenulae XG40

在貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)中，將乙酸乙酯提取物溶解在甲醇中進(jìn)行貯存時(shí)，其穩(wěn)定性較好。在-20 ℃貯存120 d時(shí)，其抑菌活性未見(jiàn)明顯下降。在4 ℃貯存120 d時(shí)，仍保持有較好的抑菌活性，抑菌帶寬為21.1 mm；在20 ℃～37 ℃貯存時(shí)，第30 d的抑菌帶寬分別為22.3、21.2和20.8 mm，至第120 d的抑菌帶寬分別下降為20.3、20.2和15.2 mm。乙酸乙酯提取物在甲醇溶解的條件下，貯存在-20 ℃可長(zhǎng)期保持良好的抑菌活性，在4 ℃能保持較好的抑菌活性，在室溫（20 ℃～28 ℃）條件下貯存時(shí)間不宜超過(guò)120 d，在37 ℃條件下貯存時(shí)間不宜超過(guò)30 d（圖6）。

圖6 溫度和貯存時(shí)間對(duì)活性成分抑菌活性的影響Fig.6 Effect of Temperature and storage period on antifungal actvity of the active component of S.catenulae XG40

3 討論

鏈霉菌具有產(chǎn)生多種生物活性次生代謝產(chǎn)物的能力，這類(lèi)次生代謝產(chǎn)物在微生物過(guò)渡到穩(wěn)定期或營(yíng)養(yǎng)條件不足時(shí)產(chǎn)生，對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)實(shí)踐有重要的影響。微生物發(fā)酵產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成過(guò)程非常復(fù)雜，容易受許多因素的相互影響，如培養(yǎng)基組成與配比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH等[25,26]。適宜的培養(yǎng)基配方?jīng)Q定發(fā)酵水平與原料成本的高低，且培養(yǎng)基各成分間存在復(fù)雜的交互作用，因此，優(yōu)化微生物培養(yǎng)基的組成尤為重要[27]。本研究綜合考慮抑菌效果、菌絲生長(zhǎng)及發(fā)酵成本等前提下，采用單因子和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，緩效碳源玉米粉比速效碳源葡萄糖更有利于小串鏈霉菌XG40的菌絲生長(zhǎng)和活性物質(zhì)的產(chǎn)生，黃豆粉和酵母粉組合作為有機(jī)氮源其菌絲生長(zhǎng)量和活性物質(zhì)產(chǎn)量比無(wú)機(jī)氮源高，說(shuō)明有機(jī)氮源更適合小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)，與王明環(huán)等[28]的報(bào)道一致。除了優(yōu)化培養(yǎng)基組成之外，菌株的活性物質(zhì)產(chǎn)生還與發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH、溫度、時(shí)間、裝液量、接種量和轉(zhuǎn)速等條件有關(guān)，通過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化可獲得最佳的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益[29,30]。同屬不同菌株的鏈霉菌在碳源、氮源利用及發(fā)酵環(huán)境條件方面存在一定差異，如直絲鏈霉菌A8[28]的碳源、氮源為可溶性淀粉30 g/L，黃豆粉6 g/L，酵母膏4 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0～8.0，溫度28 ℃～31 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d，裝液量100～200 mL，接種量3%～7 %。而暗黑鏈霉菌PY-1[29]的碳源、氮源為玉米粉50 g/L，葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0，溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間5 d，裝液量90 mL，接種量5%，轉(zhuǎn)速180 r/min。本研究小串鏈霉菌XG40優(yōu)化后的最佳碳源、氮源為玉米粉50 g/L，黃豆粉9 g/L，酵母粉6 g/L，最佳發(fā)酵條件為pH值7.0，溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，裝液量100 mL，接種量7%，轉(zhuǎn)速160 r/min。此條件下抑菌帶寬（23.3 mm）是基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下抑菌帶寬（16.8 mm）的1.39倍。上述研究結(jié)果表明小串鏈霉菌XG40與其他鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件不盡相同，原因可能與菌種自身的遺傳特性、生理特征及分離來(lái)源有關(guān)，也可能與指示菌抑菌活性評(píng)價(jià)有關(guān)，還需進(jìn)一步探究。此外，不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)微生物的生長(zhǎng)及抑菌活性也會(huì)產(chǎn)生較大的影響[29]，下一步將針對(duì)無(wú)機(jī)鹽如Na+、K+、Fe+、Mg+等進(jìn)行優(yōu)化。

生防制劑的開(kāi)發(fā)不僅要考慮抑菌效果，還要考慮活性物質(zhì)的穩(wěn)定性、生產(chǎn)和存儲(chǔ)等問(wèn)題?；钚晕镔|(zhì)在應(yīng)用時(shí)易受溫度、光照、濕度等外界環(huán)境條件的影響[7,31]。本研究采用乙酸乙酯對(duì)菌株 XG40發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取，獲得的活性物質(zhì)對(duì)琯溪蜜柚黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)具有很強(qiáng)的抑制作用，說(shuō)明乙酸乙酯能將發(fā)酵液中的活性物質(zhì)有效的提取出來(lái)，與呂昂等[31]報(bào)道的一致。放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，性質(zhì)不同，其結(jié)構(gòu)與活性、穩(wěn)定性等關(guān)系密切[32]。前人對(duì)鏈霉菌提取物穩(wěn)定性的研究報(bào)道較少。張楠[33]等報(bào)道吸水鏈霉菌BS-112產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)紫外線較為敏感，限制了其進(jìn)一步的田間應(yīng)用。王辰[23]等報(bào)道白刺鏈霉菌CT205所產(chǎn)生的活性物質(zhì)對(duì)酸堿不穩(wěn)定（pH 4-10），對(duì)熱（60 ℃、80 ℃和100 ℃分別處理15 min）和紫外光（照射30 min）穩(wěn)定性較強(qiáng)。呂昂等[31]報(bào)道鏈霉菌3-10提取物對(duì)堿不穩(wěn)定（pH 8～13），對(duì)高溫（60 ℃處理60 min抑制率下降至55.3%）和紫外線（照射20 min抑制率下降至9.7%）比較敏感，在甲醇溶解液中貯存穩(wěn)定性較好。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果不盡相同，小串鏈霉菌XG40活性物質(zhì)較耐酸堿（pH 4～10）和短時(shí)間（180 min）的紫外線照射，熱穩(wěn)定性良好（60 ℃處理60 min抑制率下降至87.8%），在甲醇溶解液中耐貯性較好，有利于運(yùn)輸和田間防治。

本研究以琯溪蜜柚黑斑病菌為指示菌，優(yōu)化了小串鏈霉菌XG40的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，易得且成本較低，其活性物質(zhì)較穩(wěn)定、易于貯存，為該菌株的田間應(yīng)用及進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)提供了前期基礎(chǔ)。下一步將對(duì)該菌株的活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及對(duì)防治其他植物病害的篩選等方面進(jìn)行探究。