幾種常用化學殺蟲劑對Bt菌株生長影響的初步研究

束長龍，張 賢，王 奎，曹蓓蓓，張 杰

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室）

作物病蟲害是危害糧食安全的主要威脅之一，我國每年由于病蟲害所致的農(nóng)作物損失巨大[1]，目前對害蟲治理主要使用化學農(nóng)藥。但是，隨著化學農(nóng)藥的使用，害蟲逐漸出現(xiàn)抗性，引起農(nóng)藥用量加大，導致了化學農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、食品安全等一系列問題。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性昆蟲病原菌，具有較高的殺蟲特異性，對哺乳動物等非靶標生物安全無害，是一種應用最廣泛的微生物殺蟲劑[2]。最近研究結(jié)果顯示，Bt與化學殺蟲劑不存在交互抗性，不僅可以替代化學殺蟲劑使用，兩者聯(lián)合使用還可以提高殺蟲效果，減少化學殺蟲劑的用量[3-6]。

Bt殺蟲劑主要活性成分是其編碼的殺蟲蛋白，同時Bt芽胞也會發(fā)揮作用。有研究表明，在殺蟲蛋白引起腸道上皮細胞損壞后，Bt芽胞會進入昆蟲血腔并萌發(fā)增殖，引起昆蟲敗血癥[7-9]。此外，在適當?shù)臈l件下，Bt芽胞在植物葉片、根系周圍也會萌發(fā)增殖，形成持續(xù)控害的作用[9]。本實驗室最近研制的可增殖顆粒載體，可以在土壤中增殖Bt，釋放二氧化碳，利用蠐螬趨性，達到提精準誘殺的目的，進一步有化學殺蟲劑聯(lián)合使用將可以進一步提高殺蟲效果[10]。然而，目前研究 Bt與化學殺蟲劑聯(lián)合使用兼容性相關(guān)研究較少，化學殺蟲劑對Bt菌株的增殖影響尚不清楚，影響了Bt殺蟲劑與化學殺蟲劑協(xié)同防控害蟲方案的應用。因此，本研究系統(tǒng)分析了目前 Bt菌株各亞種遺傳差異以及常用鱗翅目害蟲殺蟲劑有效成分對其增殖的影響，相關(guān)研究可以為進一步制定 Bt殺蟲劑與化學殺蟲劑配伍方案與協(xié)同使用技術(shù)提供理論指導與數(shù)據(jù)參考，對提高害蟲防控效果、實現(xiàn)化學農(nóng)藥減量施用具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試Bt菌株共107株，分為60個亞種類型，其中105株為Bt標準菌株，由俄亥俄州立大學的芽胞桿菌遺傳保藏中心（BacillusGenetic Stock Center，BGSC）提供；菌株HD1和G03由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所抗蟲生物技術(shù)課題組保存（表1）。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.2 供試藥劑

95%氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）原藥購自上海杜邦農(nóng)化有限公司，用甲醇溶解自制成5 g/L的母液；99%茚蟲威（indoxacarb）原藥購自南京樂邦化工有限公司，用甲醇溶解自制成10 g/L的母液；99%溴蟲腈（chlorfenapyr）原藥購自陜西惠城生物科技有限公司，用甲醇溶解為10 g/L的母液；95.3%高效氯氰菊酯（beta-cypermethrin）原藥購自江蘇常隆化工有限公司，用甲醇溶解自制成10 g/L的母液；97%定蟲?。╟hlorfluazuron）原藥購自石家莊濟泰三沐農(nóng)藥化工有限公司，用甲醇溶解自制成5 g/L的母液。

1.3 泛基因組分析

泛基因組代表某個物種所有菌株攜帶的全部基因，由核心基因（core gene）、非必需基因（dispensable gene）以及菌株特有基因（strain-specific gene）這三部分組成。其中核心基因在所有菌株中都存在，非必需基因僅在某些菌株（至少兩株）中存在，而菌株特有基因僅在單個菌株中存在。

本研究中以細菌泛基因組分析軟件（Bacterial Pan Genome Analysis Pipeline，BPGA）[11]對107株Bt菌株進行泛基因組分析。從NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中下載所分析菌株的氨基酸序列文件，并將其作為輸入數(shù)據(jù)導入BPGA軟件中，將蛋白質(zhì)序列一致性閾值設為50%，通過USEARCH算法進行序列聚類，以此鑒定核心基因、非必需基因和特有基因，分析泛基因組構(gòu)成。

1.4 菌株制備

首先將所需Bt菌株在LB平板上30 ℃進行活化培養(yǎng)，挑取單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜，將所得菌液稀釋至OD600nm＝0.1待用。

1.5 化學殺蟲劑對Bt菌株生長的影響測定

本試驗以中國農(nóng)藥信息網(wǎng)中登記的有效成分用藥量設置為處理濃度。測試過程中，取農(nóng)藥母液加入20 mL滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，配置成設定的試驗終濃度。另以含有與試驗濃度母液同體積甲醇的20 mL滅菌LB培養(yǎng)基為對照。將培養(yǎng)基分裝于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，接入準備好的OD600nm為0.1的菌液10 μL，置于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，用多功能酶標儀（Synergy 4）分別測定初始（培養(yǎng)0 h）和培養(yǎng)12 h的OD600nm值，計算OD600nm變化情況。試驗中，每個處理重復3次，計算每個處理OD600nm增加值的平均值；進一步計算每個菌株含有原藥處理的 OD600nm增加值與只含有溶劑（甲醇）處理的OD600nm增加值的比值，作為農(nóng)藥對每個菌株的影響系數(shù)。其中，茚蟲威測試過程中出現(xiàn)部分樣品污染問題，最終保留了茚蟲威對100株Bt菌株生長影響的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株泛基因組分析

首先，本研究通過菌株功能基因組成比較 Bt菌株之間遺傳學差異水平，分析菌株對化學殺蟲劑敏感性差異的可能性。通過BPGA軟件包中USEARCH算法對107株菌株所有編碼基因進行序列聚類，共獲得27142個基因家族，其中核心基因家族2559個，非必需基因家族14551個，特有基因家族10032個。每個Bt菌株平均編碼6167個基因，其中接近60%的基因是非必需的（圖1）。按照每個基因家族在測試菌株中的分布情況將基因家族按照保守程度進行歸類，即只在1個菌株中存在的基因，也就是各個菌株特有的基因，保守程度為1，在2個菌株中有分布的基因家族保守程度為2，以此類推，本研究中在所有107個菌株中都有分布的基因家族保守程度為 107，即核心基因家族。本研究統(tǒng)計了各保守程度的基因家族分布情況，結(jié)果顯示這些基因家族主要集中分布在保守程度較低與較高的兩端，并且保守程度較低的基因家族數(shù)量遠多于保守程度較高的家族。含有超過100個基因家族的保守程度類別有26個，其中低保守性的有22個，涉及21051個基因家族，占所有基因家族的77.56%；而高保守程度類別有4個，涉及的基因家族只有3436個，占所有基因家族的12.66%。上述這些數(shù)據(jù)說明Bt菌株在遺傳學上存在較大的差異，菌株個體對化學殺蟲劑的敏感性應該存在差異（圖2）。

圖1 菌株泛基因組基因家族數(shù)量統(tǒng)計Fig.1 Statistics on the number of pan-genomic gene families of strains

圖2 不同保守程度的泛基因組基因家族數(shù)量統(tǒng)計Fig.2 Statistics on the number of pan-genomic gene families with different conservation levels

2.2 化學殺蟲劑對Bt菌株影響系數(shù)分析

如圖3A顯示，化學殺蟲劑對于不同Bt菌株影響是不同的。整體來說溴蟲腈對Bt菌株影響最大，表現(xiàn)為強抑制作用，有超過85%的Bt菌株會被嚴重抑制，影響系數(shù)低于0.3；并且其中影響系數(shù)低于0.1的菌株有43株，超過所有測試菌株的40%（圖3B）。其次，高效氯氰菊酯對Bt菌株影響最小，對74.76%測試菌株影響小于10%，影響系數(shù)在0.9～1.1；而溴蟲腈、氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威與定蟲隆處理組中影響系數(shù)在此范圍的Bt菌株分別占總數(shù)的1.87%、44.86%、41.12%與39.25%。此外，與其他殺蟲劑相比，茚蟲威對更多的Bt菌株的影響表現(xiàn)為促進作用，其處理組中影響系數(shù)大于1.1的菌株占總數(shù)的33.64%（圖3B）。

圖3 化學殺蟲劑對Bt菌株影響系數(shù)Fig.3 Influence coefficients of chemical insecticides on Bt strains

2.3 菌株對不同化學殺蟲劑敏感性比較

圖4分析結(jié)果表明，對于任意兩種化學殺蟲劑來說，對單個菌株影響系數(shù)一致比例較少，影響系數(shù)差值低于0.1比例都不超過50%。也就是說對于更多的Bt菌株來說，如果某種化學殺蟲劑對其有較強的抑制，是可以篩選到另外對其無抑制或者有促進的化學殺蟲劑，與之協(xié)同使用。

圖4 菌株對不同化學殺蟲劑敏感性的成對比較Fig.4 Pairwise comparison of strains susceptibility to different chemical insecticides

2.4 化學殺蟲劑對常見Btk和Bta菌株影響分析

Bt庫斯塔克亞種（Btkurstaki，Btk）與鲇澤亞種（Btaizawai，Bta）是目前最常用的防治鱗翅目害蟲Bt殺蟲劑的亞種類型，本研究分析了化學殺蟲劑對BGSC保存的Btk與Bta標準菌株與用作殺蟲劑開發(fā)的Btk菌株HD1和Bta菌株G03的影響。研究結(jié)果如圖5所示，高效氯氰菊酯對所有Btk和Bta菌株影響都小于10%，影響系數(shù)在0.9至1.1之間；其他三種化學殺蟲劑對部分菌株影響較大。對于常用菌株HD1來說，氯蟲苯甲酰胺和茚蟲威對其有一定抑制，但是定蟲隆對其有較好的促進作用。對于G03來說，高效氯氰菊酯與茚蟲威對其影響較小，定蟲隆對其有較弱的抑制，而氯蟲苯甲酰胺對其則有一定的促進作用。

圖5 化學殺蟲劑對常見Btk和Bta菌株影響系數(shù)Fig.5 Influence coefficients of chemical insecticides on commonly used Btk and Bta strains

3 討論

化學殺蟲劑在挽回糧食損失中起到了極其重要的作用。然而長期過量施用品種單一的化學殺蟲劑，不僅會對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生不利影響，還會導致害蟲抗藥性上升，難以防治，影響我國的糧食安全。Bt殺蟲劑作為一種環(huán)境友好的生物殺蟲劑，不僅對人畜無害，還可以保護天敵，實現(xiàn)持續(xù)控害[8]。此外，用作殺蟲劑的 Bt菌株通常同時表達多種不同作用機制的殺蟲蛋白，這些蛋白分別作用于靶標害蟲中腸不同的受體，使得害蟲不易產(chǎn)生抗性[12,13]，最近研究結(jié)果顯示，Bt殺蟲劑不僅對化學殺蟲劑抗性害蟲有較好的防控作用，而且可以與化學殺蟲劑協(xié)同使用，達到減少殺蟲劑用量，提高防治效果的作用[3-6]。因此，Bt與化學殺蟲劑協(xié)同使用可以兼顧防治效果、抗性治理以及成本控制等多方面需求，具有巨大的應用前景。然而，目前對 Bt與化學殺蟲劑配伍與協(xié)同使用的理論研究較少，阻礙了該技術(shù)的推廣應用，因此，本論文針對該問題開展了相關(guān)研究工作。

本研究利用本實驗室保存的不同亞種的蘇云金芽胞桿菌菌株資源，從遺傳學和實驗數(shù)據(jù)兩方面開展了研究。泛基因組分析表明，不同Bt菌株之間存在大量的基因水平的差異，這使得Bt菌株對化學殺蟲劑的敏感性可能有所不同，為進一步配伍與協(xié)同使用方案制定提供了遺傳學理論基礎。而進一步化學殺蟲劑對Bt增殖的影響研究表明，部分化學殺蟲劑（溴蟲腈）對包括常用Bt生產(chǎn)菌株在內(nèi)的大部分測試菌株都有抑制作用，說明Bt殺蟲劑與化學殺蟲劑協(xié)同使用時，需要進行兼容性測定。盡管如此，研究數(shù)據(jù)顯示Bt菌株中還存在一定數(shù)量的個體可以適應溴蟲腈，說明即使對 Bt有抑制的化學殺蟲劑，通過篩選，也是可以獲得與之協(xié)同使用的Bt菌株。

對大部分供試化學殺蟲劑而言，其對 Bt增殖影響是多樣的。這個結(jié)果說明，當針對某一特定化學殺蟲劑，是可以篩選到可以與之配伍或協(xié)同使用的Bt菌株；同樣，針對某一特定Bt殺蟲劑，也可以篩選到與其協(xié)同使用的化學殺蟲劑，并且有可能獲得對 Bt增殖有促進的組合。最后，還統(tǒng)計了化學殺蟲劑對常用的Btk和Bta菌株的影響，結(jié)果說明高效氯氰菊酯對所有Btk和Bta菌株影響都不大，可以與常用Bt殺蟲劑進行協(xié)同使用；利用HD1菌株生產(chǎn)的Bt殺蟲劑盡量避免與茚蟲威一起使用，而與啶蟲隆一起使用可能會有較好的效果。

需要注意的是本研究是在化學殺蟲劑原藥與 Bt菌株層面開展的研究，實際應用過程中還要考慮殺蟲劑的各種制劑中的添加成分對Bt的影響。總的來說，本研究初步分析了化學殺蟲劑對Bt菌株增殖的影響，研究結(jié)果表明化學殺蟲劑與 Bt殺蟲劑協(xié)同使用前需要進行兼容性測定，并且可以通過兼容性篩選獲得更優(yōu)的組合。相關(guān)研究為進一步化學殺蟲劑與Bt殺蟲劑合理協(xié)同使用提供了理論指導。