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    RNAi沉默HvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲幼蟲存活及發(fā)育的影響

    2022-11-18 08:26:10王亞潔劉卓琦李華麗潘慧鵬楊春曉
    中國生物防治學(xué)報(bào) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:瓢蟲滴度多巴胺

    王亞潔,劉卓琦,李華麗,潘慧鵬,楊春曉*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省生物農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

    FTZ-F1(Fushi-tarazu factor 1)是昆蟲體內(nèi)一種典型的核受體轉(zhuǎn)錄因子,在昆蟲的蛻皮、化蛹和成蟲繁殖中起到至關(guān)重要的作用。FTZ-F1在昆蟲多個(gè)組織中作為功能因子響應(yīng)20E(20-hydroxyecdysone,20-羥基蛻皮酮)信號(hào),并介導(dǎo)下游基因的表達(dá)[1]。20E前體ecdysone在前胸腺(prothoracic glands,PGs)中合成并分泌到血淋巴,隨體液循環(huán)進(jìn)入靶細(xì)胞,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被細(xì)胞色素P450羥化酶Shade(Cyp314a1)催化生成20E[2]。20E調(diào)節(jié)昆蟲的蛻皮及變態(tài)發(fā)育,是昆蟲生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵組分,由細(xì)胞色素P450單加氧酶基因、spook、phantom、disembodied(DIB)、shadow和shade等基因共同參與合成[3]。在完全變態(tài)昆蟲中,20E通過與蛻皮激素受體(ecdysone receptor,ECR)/超螺旋體(ultraspiracle,USP)異源二聚體結(jié)合來激活broad complex(BRC)、E74(Ecdysone-induced protein 74)、E75(Ecdysone-induced protein 75)和E93(Ecdysone-induced protein 93)等蛻皮激素早期應(yīng)答基因的表達(dá)[4,5]。這些早期應(yīng)答基因編碼的蛋白再激活HR3(hormone receptor 3)、HR4(hormone receptor 4)、HR38(hormone receptor 38)等中期應(yīng)答基因的表達(dá),隨后這些中期應(yīng)答基因編碼的蛋白通過誘導(dǎo)核受體因子FTZ-F1再觸發(fā)晚期基因的表達(dá)[5,6]。因此,核受體FTZ-F1在20E通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。沉默昆蟲的FTZ-F1基因,昆蟲體內(nèi)20E相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)受到影響。例如,在馬鈴薯葉甲Leptinotarsa decemlineata中,沉默LdFTZ-F1會(huì)影響幼蟲化蛹,顯著抑制20E相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,并降低20E滴度[7]。在果蠅Drosophila melanogaster中沉默DmFTZ-F1會(huì)導(dǎo)致phantom、DIB、shadow表達(dá)量的降低[8]。

    在蛻皮過程中,TH(tyrosine hydroxylase)、DDC(Dopa decarboxylase)、laccase2和ebony等色素合成基因調(diào)控昆蟲體色的形成[9]。酪氨酸羥化酶(TH)將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴(Dopa);之后,多巴脫羧酶(DDC)將多巴轉(zhuǎn)化為黑色素的前體多巴胺(Dopamine);laccase2通過多巴和多巴胺催化黑色素的產(chǎn)生[9-12]。合成的色素前體從表皮細(xì)胞中分泌出來,然后摻入表皮,形成可視化的黑色斑紋和斑點(diǎn)。多巴胺還可由ebony轉(zhuǎn)化為N-β-丙烯基多巴胺(NBAD),參與表皮鞣化,使表皮呈現(xiàn)黃色或者淡黃色[13]。研究發(fā)現(xiàn)20E調(diào)控色素相關(guān)基因的表達(dá),并且20E和保幼激素(JH)對(duì)昆蟲體內(nèi)總多巴胺水平具有特異性影響[11,14,15]。FTZ-F1首次在果蠅中發(fā)現(xiàn),編碼α型和β型兩種蛋白質(zhì),已有研究證明βFTZ-F1參與調(diào)控昆蟲蛹?xì)ば纬?,是表皮形成所必須的[16]。沉默昆蟲體內(nèi)FTZ-F1基因會(huì)導(dǎo)致幼蟲蛻皮失敗并死亡。例如,將赤擬谷盜Tribolium castaneum5齡幼蟲注射800~1000 ng dsTcFTZ-F1造成100%的幼蟲在化蛹前死亡[17]。在黑腹果蠅Drosophila melanogaster中,βFTZ-F1調(diào)控蛻皮和變態(tài)相關(guān)基因,沉默DmFTZ-F1會(huì)抑制幼蟲蛻皮直至死亡[18]。在德國小蠊Blattella germanica中,BgFTZ-F1控制蛻皮脈沖的時(shí)間,沉默BgFTZ-F1導(dǎo)致幼蟲生長發(fā)育遲緩和蛻皮失敗[19]。BmFTZ-F1與家蠶Bombyx mori幼蟲蛻皮和羽化有關(guān)[20]。沉默棉鈴蟲Helicoverpa armigera4齡幼蟲的HaFTZ-F1基因,導(dǎo)致幼蟲蛻皮過程受到抑制[21]。以上研究都表明FTZ-F1在昆蟲蛻皮過程中起著至關(guān)重要的作用。

    茄二十八星瓢蟲Henosepilachna vigintioctopunctata屬于鞘翅目、瓢蟲科,主要為害茄科植物,如馬鈴薯Solanum tuberosum、番茄Lycopersicon esculentum、茄子Solanum melongena等。自2015年起,我國推進(jìn)馬鈴薯主糧化,近年來,隨著馬鈴薯種植面積不斷擴(kuò)大,茄二十八星瓢蟲的為害愈加嚴(yán)重[22]。目前,化學(xué)防治仍然是防控茄二十八星瓢蟲的主要手段。然而由于化學(xué)藥劑長期、不合理地使用會(huì)引起環(huán)境污染以及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題。因此,制定其他防控策略來對(duì)茄二十八星瓢蟲進(jìn)行綜合治理非常有必要[23]。RNA干擾(RNA interference,RNAi)指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(doublestranded RNA,dsRNA)在生物體內(nèi)被核酸內(nèi)切酶 Dicer切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段siRNA,之后通過序列配對(duì)的模式干擾靶標(biāo)基因翻譯蛋白過程或降解 mRNA序列,從而產(chǎn)生基因沉默的現(xiàn)象[24]。近十年,RNAi在害蟲防治中的應(yīng)用得到了廣泛的研究[25-28]。RNAi已成為了通過抑制基因表達(dá)進(jìn)行害蟲生物防治的有效手段。以RNAi為基礎(chǔ)的害蟲防治是控制茄二十八星瓢蟲的一個(gè)潛在可行的解決方案[28-32]。

    為篩選基于RNAi技術(shù)的茄二十八星瓢蟲綠色防控的候選靶標(biāo)基因,通過飼喂茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲100 ng/μL的dsHvFTZ-F1處理過的葉片,使得幼蟲無法蛻皮進(jìn)入2齡,直至死亡,死亡率為90%[32]。在本研究中,我們利用飼喂法RNAi,探究低濃度處理下沉默HvFTZ-F1基因?qū)η讯诵瞧跋x存活和發(fā)育的影響,為降低防控成本、實(shí)現(xiàn)RNA生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試植物與蟲源

    本研究所用的茄二十八星瓢蟲于2018年4月采集自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)的龍葵,將瓢蟲與葉片均置于放有濾紙和棉球保濕的培養(yǎng)皿中,在人工氣候箱中繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度70%~80%,光周期14L∶10D。

    1.2 RNA的提取與cDNA的合成

    采用TRIzol法提取樣品總RNA,使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)測定RNA濃度,所有樣本RNA的OD260/OD230在1.8~2.2。使用試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,Dalian,China)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所得cDNA稀釋10倍用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.3 dsRNA的體外合成

    使用包含T7啟動(dòng)子序列的特異性引物[33]進(jìn)行HvFTZ-F1和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)dsRNA 的合成。PCR 反應(yīng)體系:10 μL 5×PCR buffer,1.0 μL dNTP mix,5.0 μL 上游引物(10 μmol/L),5.0 μL 下游引物(10 μmol/L),0.25 μLTaq(5 U/μL)(TaKaRa,China)。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,使用 DNA膠回收試劑盒(Tiangen,Beijing,China)進(jìn)行回收,作為合成dsRNA的模板。使用MEGAscript T7 RNAi試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)合成dsRNA,分別得到dsHvFTZ-F1和dsGFP。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA質(zhì)量并使用儀器NanoDrop OneC分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,USA)測定dsRNA濃度。

    1.4 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活和發(fā)育的影響

    用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1溶液浸泡直徑為12 mm的圓形茄子葉片1 min,待葉片自然風(fēng)干后飼喂茄二十八星瓢蟲1齡初幼蟲,每隔24 h更換一次葉片,飼喂dsHvFTZ-F1處理的葉片48 h后,更換為新鮮的未經(jīng)dsRNA處理的茄子葉片。將幼蟲放入有濾紙和加濕棉球的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng),用相同方法以5 ng/μL的dsGFP作為對(duì)照組。每個(gè)dsRNA濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)含有10頭1齡幼蟲,培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中(溫度25 ℃±1 ℃,相對(duì)濕度70%~80%,光周期14L∶10D)。每隔12 h統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中茄二十八星瓢蟲的死亡數(shù)目,拍攝并記錄dsRNA處理下茄二十八星瓢蟲的存活和發(fā)育情況。

    1.5 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E和色素沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

    用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1處理1齡幼蟲。每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),設(shè)置3個(gè)重復(fù),處理后48 h收樣。所有樣本均用液氮迅速冷凍,用1.5 mL無RNA酶的離心管保存于-80 ℃,之后進(jìn)行總RNA的提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。所得cDNA用于檢測dsHvFTZ-F1處理后對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲HvFTZ-F1基因、20E相關(guān)基因(HvSPOOK,HvSHADOW,HvSHADE,HvDIB,HvE75,HvECR,HvHR3)和色素沉積相關(guān)基因(HvDDC,HvTH,Hvebony)表達(dá)量的影響。

    1.6 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E滴度的影響

    為研究HvFTZ-F1沉默對(duì)20E滴度的影響,首先通過連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)20E溶液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1和5 ng/μL的dsGFP(對(duì)照組)處理1齡幼蟲,每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),設(shè)置3個(gè)重復(fù),處理后48 h收樣。所收樣本以1∶9(w/v)比例加入PBS緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),使用研磨器(Tiangen,China)在冰上充分研磨并稀釋。所得勻漿以5000 r/min離心10 min,使用昆蟲蛻皮酮酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Insect Ecdysone ELISA Kit,MLBIO,China)測定上清液中20E滴度。使用酶標(biāo)儀(BIO-RAD,CA,USA)測定光密度(optical densities,ODs)。

    1.7 取食dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度的影響

    為研究HvFTZ-F1沉默對(duì)多巴胺滴度的影響,首先通過連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)多巴胺溶液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別用5 ng/μL的dsHvFTZ-F1和5 ng/μL的dsGFP(對(duì)照組)處理1齡幼蟲,每10頭幼蟲為1個(gè)生物學(xué)重復(fù),設(shè)置3個(gè)重復(fù),處理后48 h收樣。所收集樣本以1∶9(w/v)的比例加入PBS緩沖液,使用研磨器在冰上充分研磨并稀釋。所得勻漿以3000 r/min離心20 min,使用昆蟲多巴胺酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Insect Dopamine ELISA kit,NJJCBIO,China)對(duì)上層清液進(jìn)行多巴胺濃度測定。使用酶標(biāo)儀(iMark,BIO-RAD,USA)檢測OD值。

    1.8 RT-qPCR分析

    對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR分析,RT-qPCR的反應(yīng)體系:cDNA模板1.0 μL,引物F和R(10 μmol/L)各 0.625 μL,TB Green 7.5 μL,ddH2O 5.25 μL,共 15 μL。RT-qPCR 反應(yīng)程序?yàn)?3 個(gè)階段,分別為變性階段95 ℃,30 s;定量分析階段(95 ℃,5 s;60 ℃,30 s)40個(gè)循環(huán);熔解曲線分析階段(65 ℃~95 ℃,每升溫0.5 ℃檢測一次熒光信號(hào),每次檢測持續(xù)5 s)[33]。反應(yīng)在96孔板Microseal PCR plates中進(jìn)行,RT-qPCR的反應(yīng)儀器為Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system(Bio-Rad C1000 Real-Time PCR system,BIO-RAD,USA)。使用HvRPS18和HvRPL13作為內(nèi)參基因,各基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[34],所用引物序列參照之前研究[33]。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析HvFTZ-F1及相關(guān)基因在處理組和對(duì)照組中的表達(dá)水平差異,以及比較不同處理下 20E滴度和多巴胺滴度的差異(P<0.05)。百分比數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行反正弦平方根變換。使用IBM SPSS Statistics v.24.0軟件(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲生存及發(fā)育的影響

    經(jīng)5 ng/μL的dsRNA處理后,dsGFP對(duì)照組幼蟲在處理3 d后發(fā)育至2齡。dsHvFTZ-F1處理的幼蟲無法蛻皮進(jìn)入2齡直至死亡,并且所有幼蟲的死亡狀態(tài)均為后腸從肛門處伸出(圖1)。

    圖1 茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲經(jīng)dsHvFTZ-F1處理3 d后表型的變化Fig.1 Phenotypic changes of the H.vigintioctopunctata 1st instar larvae treated with dsHvFTZ-F1 for 3 days

    取食dsHvFTZ-F1處理的葉片,可導(dǎo)致茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲的死亡率達(dá)65.00%(t=16.57,df=8,P<0.0001)(圖2)。

    圖2 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活率的影響Fig.2 The impact of ingetion of 5 ng/μLdsHvFTZ-F1 treated leaves on the survival rate of the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

    2.2 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E和色素沉積相關(guān)基因表達(dá)的影響

    經(jīng)dsHvFTZ-F1處理2 d后,1齡幼蟲的HvFTZ-F1基因表達(dá)水平顯著降低了63.69%(t=4.426,df=4,P=0.011);HvE75(t=11.173,df=2,P=0.008)的表達(dá)水平降低了 20.76%;HvHR3(t=3.636,df=2,P=0.068)、HvECR(t=0.14,df=2,P=0.901)的表達(dá)量無顯著變化(圖3A)。

    同樣,經(jīng)dsHvFTZ-F1處理后HvDIB、HvSPOOK、HvSHADOW、HvSHADE表達(dá)水平顯著降低,分別下調(diào) 85.36%(t=118.238,df=2,P<0.0001),66.32%(t=49.844,df=2,P<0.0001),52.74%(t=20.336,df=2,P=0.002),31.12%(t=10.993,df=2,P=0.008)(圖 3B)。

    HvDDC、HvTH、Hvebony表達(dá)水平在5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理后顯著降低,分別降低了88.74%(t=36.913,df=4,P<0.0001),91.97%(t=55.982,df=2,P<0.0001),86.15%(t=47.937,df=2,P<0.0001)(圖3C)。

    圖3 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中HvFTZ-F1及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.3 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the gene expression of HvFTZ-F1 and related genes in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

    2.3 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲20E滴度的影響

    經(jīng)dsHvFTZ-F1處理2 d后,1齡幼蟲的20E滴度顯著降低了15.97%(t=3.693,df=4,P=0.021)(圖4)。

    圖4 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中20E滴度的影響Fig.4 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the 20E titer in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

    2.4 dsHvFTZ-F1處理對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度的影響

    1齡幼蟲的多巴胺滴度在dsHvFTZ-F1處理2 d后顯著降低了21.38%(t=44.281,df=4,P<0.0001)(圖5)。

    圖5 取食5 ng/μL dsHvFTZ-F1處理的葉片對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲中多巴胺滴度的影響Fig.5 The impact of ingetion of 5 ng/μL dsHvFTZ-F1 treated leaves on the dopamine titer in the 1st instar larvae of H.vigintioctopunctata

    3 討論

    近期研究發(fā)現(xiàn)HvFTZ-F1基因在茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲和2齡幼蟲中的表達(dá)量顯著高于3齡和4齡幼蟲中的表達(dá)量,在幼蟲階段每次蛻皮前或蛻皮時(shí)高表達(dá)[32]。并且HvFTZ-F1在預(yù)蛹期高表達(dá),與FTZ-F1基因在赤擬谷盜[17]、馬鈴薯葉甲[7]、棉鈴蟲[21]等昆蟲中的研究結(jié)果相似。HvFTZ-F1在不同發(fā)育階段的特異表達(dá)模式,表明HvFTZ-F1是茄二十八星瓢蟲生存發(fā)育過程中的關(guān)鍵基因。

    為了探究HvFTZ-F1的功能,我們通過飼喂dsHvFTZ-F1抑制茄二十八星瓢蟲HvFTZ-F1基因的表達(dá),結(jié)果表明HvFTZ-F1基因沉默會(huì)導(dǎo)致茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲出現(xiàn)發(fā)育障礙并死亡。經(jīng)處理的1齡幼蟲不能正常蛻皮進(jìn)入2齡,表明HvFTZ-F1在茄二十八星瓢蟲蛻皮中發(fā)揮重要作用。在黑腹果蠅、淡色庫蚊Culex pipiens pallens等昆蟲中,F(xiàn)TZ-F1對(duì)于表皮形成均有影響,進(jìn)一步說明HvFTZ-F1可能參與茄二十八星瓢蟲表皮的形成[35,36]。處理組幼蟲的死亡狀態(tài)均為后腸攜帶新鮮糞便從肛門伸出,之前的研究表明,100 ng/μL dsHvFTZ-F1也會(huì)導(dǎo)致1齡幼蟲出現(xiàn)同樣的死亡狀態(tài),同時(shí)伴隨滲透壓基因的顯著升高,因此我們推測,低劑量的dsHvFTZ-F1處理同樣能影響茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲的滲透壓調(diào)節(jié)[32]。

    HvFTZ-F1沉默導(dǎo)致1齡幼蟲Halloween基因(HvDIB、HvSPOOK、HvSHADOW、HvSHADE)和20E相關(guān)基因HvE75表達(dá)水平不同程度的下調(diào),顯著降低了幼蟲體內(nèi)的20E滴度。在果蠅、馬鈴薯甲蟲和棉鈴蟲等昆蟲中,RNAi介導(dǎo)的FTZ-F1沉默導(dǎo)致蛻皮激素滴度顯著降低[7,8,21],我們的研究結(jié)果與在這些昆蟲中的研究結(jié)果一致,表明HvFTZ-F1參與茄二十八星瓢蟲的20E信號(hào)通路。并且,HvFTZ-F1沉默降低了色素沉著相關(guān)基因(HvTH,HvDDC,Hvebony)的表達(dá)水平。有研究報(bào)道,在亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis和西方蜜蜂Apis mellifera中,20E相關(guān)基因影響了色素沉積相關(guān)基因的表達(dá)。向亞洲玉米螟注射20E會(huì)導(dǎo)致Oflaccase2表達(dá)水平升高[37];西方蜜蜂Amlaccase2的表達(dá)水平受蛻皮激素的調(diào)節(jié),且Amlaccase2在成蟲外骨骼分化過程中起重要作用,其表達(dá)的改變可導(dǎo)致蛻皮激素釋放受阻和外骨骼異常[38]。類似的其他報(bào)道稱,向棉鈴蟲注射20E促進(jìn)了TH的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)一步加強(qiáng)了色素相關(guān)基因與20E的相關(guān)性[39]。20E可能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子參與黑色素生化模塊的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)昆蟲蛻皮后的黑化和硬化。

    另外,HvFTZ-F1沉默降低了茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲多巴胺滴度,因此我們推測FTZ-F1可通過調(diào)控20E信號(hào),控制色素合成基因的表達(dá)和多巴胺滴度,并影響昆蟲蛻皮,或HvFTZ-F1直接參與茄二十八星瓢蟲多巴胺的合成,但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。在煙草天蛾Manduca sexta中,注射20E會(huì)抑制表皮黑色素沉積[11],說明蛻皮激素滴度的降低會(huì)啟動(dòng)黑色素合成信號(hào)通路,還需進(jìn)一步探究茄二十八星瓢蟲體內(nèi)的20E滴度下降對(duì)多巴胺滴度的變化的影響。

    本研究首次采用低濃度 5 ng/μL的 dsHvFTZ-F1處理茄二十八星瓢蟲 1齡幼蟲,以探究低濃度dsHvFTZ-F1對(duì)茄二十八星瓢蟲1齡幼蟲存活和發(fā)育的影響。相較于之前采用100 ng/μL dsHvFTZ-F1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[32],較低濃度的dsRNA處理同樣也能夠造成生長發(fā)育障礙及較高的死亡率。HvFTZ-F1基因可被認(rèn)為是一個(gè)潛在的靶標(biāo)基因,用于開發(fā)基于RNAi技術(shù)的生物農(nóng)藥防治茄二十八星瓢蟲。

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