基于微衛(wèi)星標(biāo)記的甌江唇魚(yú)骨增殖放流效果評(píng)估

郭愛(ài)環(huán) 原居林 練青平 曹容瑋，2 陳光美

(1 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001；2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 3 浙江豐和漁業(yè)有限責(zé)任公司，浙江麗水 323000)

唇魚(yú)骨(Hemibarbuslabeo)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、魚(yú)骨屬(Hemibarbus)，廣泛分布于我國(guó)閩江、錢(qián)塘江、長(zhǎng)江、黃河、黑龍江等各大水系，是1種重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[1]。唇魚(yú)骨主要以水生無(wú)脊椎動(dòng)物及軟體動(dòng)物為食，營(yíng)底棲生活，生長(zhǎng)迅速，通常在2齡左右達(dá)性成熟，繁殖期集中在每年4—5月[2-3]。

甌江是浙江省內(nèi)的第二大河流[4]，位于浙江省東南部，屬典型的山溪性河流，溪流性魚(yú)類(lèi)資源豐富[5]。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、水域污染及水利工程建設(shè)等原因，甌江魚(yú)類(lèi)野生資源日益衰退[6]，因此，開(kāi)展人工增殖放流成為恢復(fù)甌江魚(yú)類(lèi)野生資源最有效的方法之一。近年來(lái)，作為甌江土著魚(yú)類(lèi)品種之一的唇魚(yú)骨被大量放流，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年浙江省唇魚(yú)骨的增殖放流數(shù)量為9 440萬(wàn)尾(從全國(guó)水生生物資源養(yǎng)護(hù)信息采集系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)獲取)。在如此大規(guī)模增殖放流的態(tài)勢(shì)下，亟須開(kāi)展唇魚(yú)骨增殖放流效果評(píng)估，為今后的增殖放流策略、實(shí)施和適應(yīng)性管理提供重要參考依據(jù)。

內(nèi)陸漁業(yè)增殖放流效果評(píng)估普遍采用剪鰭標(biāo)記、鱗片耳石標(biāo)志、體內(nèi)外物理標(biāo)記和化學(xué)熒光物質(zhì)浸泡標(biāo)記等方法[7]。與這些標(biāo)記方法相比，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記具有減少魚(yú)體損傷、標(biāo)記不易丟失、標(biāo)記檢測(cè)過(guò)程完全不受魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)和活動(dòng)影響等優(yōu)勢(shì)。此外，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記具有數(shù)量大的特點(diǎn)，不但可以檢測(cè)個(gè)體，還適合群體的大規(guī)模標(biāo)記[8-9]，因此已成為準(zhǔn)確和長(zhǎng)期評(píng)估增殖放流效果最有效的手段[10-11]。目前已有很多基于微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行內(nèi)陸水域增殖放流效果評(píng)估的研究報(bào)道，如成為為等[12]通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法對(duì)長(zhǎng)江上游胭脂魚(yú)(Myxocyprinusasiaticus)增殖放流的效果進(jìn)行了評(píng)估，推算出增殖放流的胭脂魚(yú)對(duì)長(zhǎng)江中上游野生群體的貢獻(xiàn)率為16.92%。除此之外，通過(guò)對(duì)“四大家魚(yú)”中的鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)和草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)開(kāi)展基于微衛(wèi)星和線(xiàn)粒體DNA分子標(biāo)記的增殖放流效果評(píng)估，結(jié)果說(shuō)明，連續(xù)的增殖放流活動(dòng)對(duì)漁業(yè)資源量的恢復(fù)具有累加效果[13-14]。

目前，有關(guān)唇魚(yú)骨的研究主要集中在人工繁殖[15]、養(yǎng)殖技術(shù)[16]、生理生化[3]、微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)[17-19]、線(xiàn)粒體基因組解析[20]等方面，將唇魚(yú)骨微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于其增殖放流效果評(píng)估的研究報(bào)道較少。鑒于此，本研究以甌江唇魚(yú)骨回捕群體和放流子代的親本為研究對(duì)象，利用篩選出的高度多態(tài)性微衛(wèi)星引物，通過(guò)親本與回捕個(gè)體的遺傳信息比對(duì)，識(shí)別回捕群體中的放流個(gè)體，對(duì)甌江唇魚(yú)骨增殖放流效果進(jìn)行評(píng)估，以期為甌江唇魚(yú)骨的增殖放流提供指導(dǎo)和建議。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2017年5月，在浙江省麗水市蓮都區(qū)金滿(mǎn)水產(chǎn)苗種場(chǎng)選取28尾唇魚(yú)骨繁殖親本，共14個(gè)分組，其中分組1由1尾雌性個(gè)體(HL-1F)和1尾雄性個(gè)體(HL-1M)配對(duì)組成。將每個(gè)分組分別放在不同孵化池中進(jìn)行子代繁殖，然后將繁殖的子代轉(zhuǎn)移至池塘內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)。2017年12月，將繁殖的唇魚(yú)骨子代進(jìn)行放流，放流數(shù)量為5萬(wàn)尾，放流點(diǎn)為甌江的大港頭水域，具體放流點(diǎn)情況見(jiàn)表1。剪取唇魚(yú)骨繁殖親本的鰭條，置于4 ℃冰箱內(nèi)用無(wú)水乙醇保存?zhèn)溆谩?018年8月開(kāi)始在放流區(qū)域進(jìn)行放流回捕，3個(gè)采樣點(diǎn)分別位于大港頭、碧湖和南明湖(見(jiàn)表1)，合計(jì)回捕唇魚(yú)骨103尾。測(cè)量回捕唇魚(yú)骨的體長(zhǎng)、體質(zhì)量等形態(tài)學(xué)參數(shù)(見(jiàn)表2)，并剪取鰭條，于4 ℃冰箱中用無(wú)水乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 唇魚(yú)骨放流點(diǎn)和采樣點(diǎn)情況

表2 唇魚(yú)骨子代采樣信息

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增和測(cè)序

選用10對(duì)唇魚(yú)骨的微衛(wèi)星引物[19,21](見(jiàn)表3)，分別在F正向引物末端標(biāo)記上2種常用的熒光引物(5-HEX和5-FAM)[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25 μLTaqMasterMix(康為世紀(jì)生物科技有限公司)，2 μL上、下游引物稀釋液，1 μL DNA稀釋液，20 μL去離子水。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，在各自引物的退火溫度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。4 ℃保存PCR產(chǎn)物，然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)后，用ABI 3730測(cè)序儀測(cè)取等位基因值，利用軟件GeneMarker V1.5讀取等位基因大小值[由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Cervus 3.0[22]軟件統(tǒng)計(jì)各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)和非親權(quán)排除率(NEP)。本研究用Cervus 3.0提供的最大似然法(ML)來(lái)分析親子關(guān)系，設(shè)置95%和80%兩個(gè)顯著水平，設(shè)定模擬參數(shù)如下：位點(diǎn)應(yīng)用比例為1.0；潛在基因型錯(cuò)誤率為1%，模擬運(yùn)行100 000次。利用Genepop 4.0.10軟件檢驗(yàn)微衛(wèi)星位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡。

表3 10對(duì)唇魚(yú)骨的微衛(wèi)星熒光引物參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性

本研究使用的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均能在唇魚(yú)骨家系樣本和子代中獲得穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)。結(jié)果顯示：10個(gè)位點(diǎn)在唇魚(yú)骨樣品中共檢測(cè)出等位基因數(shù)133個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為13.3個(gè)，單個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)為7～19個(gè)；多態(tài)信息含量(PIC)為0.501～0.883，平均多態(tài)信息含量為0.703，均表現(xiàn)出高度多態(tài)性；期望雜合度(He)為0.523～0.897，平均期望雜合度為0.737；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.328～0.787，平均觀測(cè)雜合度為0.598。另外，除了座位Hma046、HL41和HL44未偏離Hardy-Weinberg平衡，其他座位均偏離了Hardy-Weinberg平衡。唇魚(yú)骨微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性參數(shù)詳見(jiàn)表4。

圖1 唇魚(yú)骨部分微衛(wèi)星位點(diǎn)基因分型結(jié)果

表4 唇魚(yú)骨微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性參數(shù)

2.2 親子關(guān)系鑒定結(jié)果分析

Cervus 3.0軟件結(jié)果表明，在父母雙親未知的情況下，非親排除率(NEP)的范圍為0.043～0.400；累計(jì)非親排除率(CEP)在第3個(gè)座位時(shí)達(dá)到0.99以上，在第10個(gè)座位時(shí)達(dá)到0.999 999 62(見(jiàn)表5)。

表5 唇魚(yú)骨親子鑒定非親排除率和累計(jì)非親排除率

在95%置信度和LOD值(似然率的自然對(duì)數(shù)值)大于0的條件下，在較高的座位累計(jì)非親排除率回捕103尾樣本，其中3尾回捕唇魚(yú)骨個(gè)體經(jīng)確認(rèn)為本次放流的子代，因此，增殖放流對(duì)唇魚(yú)骨自然資源的貢獻(xiàn)率為2.91%。唇魚(yú)骨親子鑒定結(jié)果見(jiàn)表6。依據(jù)樣本編號(hào)，被鑒定出來(lái)的3尾唇魚(yú)骨中，1尾來(lái)自碧湖采樣點(diǎn)，其余2尾來(lái)自大港頭采樣點(diǎn)。

表6 唇魚(yú)骨親子鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 微衛(wèi)星座位多態(tài)性及親子鑒定分析

親子鑒定的準(zhǔn)確率主要取決于微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性[23]，而等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為，微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量越高，微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性就越高。Botstein等[24]認(rèn)為，微衛(wèi)星標(biāo)記He>0.6和PIC>0.5是最可信的辨別。本研究結(jié)果表明，10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為0.501～0.883，平均多態(tài)信息含量為0.703，均表現(xiàn)為高度多態(tài)性；期望雜合度(He)為0.523～0.897，平均期望雜合度為0.737；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.328～0.787，平均觀測(cè)雜合度為0.598，因此，用于本研究的10對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記均具有較高的多態(tài)性。Hardy-Weinberg平衡是指在理想狀態(tài)下，各等位基因的頻率和等位基因的基因型頻率在遺傳中是穩(wěn)定不變的，即保持著基因平衡。一般沒(méi)有選擇、突變、遺傳漂變以及隨機(jī)交配的自然種群的遺傳數(shù)據(jù)都符合Hardy-Weinberg平衡。本研究10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)中，只有3個(gè)座位符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，推測(cè)原因可能與樣本數(shù)量有關(guān)，群體樣本量較少會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏離Hardy-Weinberg平衡，或者SSR引物擴(kuò)增可能出現(xiàn)無(wú)效等位基因。另外，累計(jì)排除率也是影響親子鑒定的重要標(biāo)準(zhǔn)，如各位點(diǎn)排除率、位點(diǎn)數(shù)量和樣品總數(shù)等均會(huì)影響累計(jì)排除率。研究表明，位點(diǎn)的等位基因越多，其排除率越高；使用的位點(diǎn)數(shù)越多，總排除率越高；樣本數(shù)越多，總排除率越高[25]，累計(jì)排除率的最低標(biāo)準(zhǔn)一般為達(dá)到95%[26]。楊習(xí)文等[27]在對(duì)長(zhǎng)江江蘇段的鰱進(jìn)行親子鑒定時(shí)，所使用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的累計(jì)排除率達(dá)99.99%以上；成為為等[12]在對(duì)長(zhǎng)江胭脂魚(yú)進(jìn)行增殖放流評(píng)估時(shí)選用了11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，累計(jì)排除率為99.998 3%；李小芳[14]在對(duì)鰱進(jìn)行增殖放流評(píng)估時(shí)，選用了14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，累計(jì)排除率為99.91%。當(dāng)雙親未知，累計(jì)排除率大于99%時(shí)，親子鑒定的結(jié)果基本可信。本研究選用了10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，當(dāng)雙親未知時(shí)，累計(jì)排除率大于99.99%，因此，本研究選用的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)已含有足夠的遺傳信息用于親子關(guān)系分析，由此得到的親子鑒定結(jié)果可信度較高。

3.2 增殖放流效果評(píng)估

開(kāi)展增殖放流效果評(píng)估，根據(jù)結(jié)果對(duì)其資源修復(fù)作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以為下一步增殖放流工作的開(kāi)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。目前，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展增殖放流效果評(píng)估已成為準(zhǔn)確和長(zhǎng)期評(píng)估增殖放流效果最有效的手段之一。本研究運(yùn)用此方法評(píng)估出唇魚(yú)骨放流子代對(duì)野生群體的貢獻(xiàn)率為2.91%，說(shuō)明在甌江的唇魚(yú)骨群體中存在一定數(shù)量的放流個(gè)體，同時(shí)增殖放流對(duì)唇魚(yú)骨的資源量補(bǔ)充起到了一定的作用。本研究增殖放流的回捕率低于已有研究中的大部分魚(yú)類(lèi)，如長(zhǎng)江鰱的增殖放流貢獻(xiàn)率為8.21%[27]，胭脂魚(yú)的貢獻(xiàn)率為16.92%[12]，而張敏瑩等[28]在錢(qián)塘江開(kāi)展的三角魴增殖放流效果評(píng)估結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三角魴增殖放流的資源貢獻(xiàn)率僅為1.08%。筆者推測(cè)，放流群體數(shù)量少是本研究回捕魚(yú)類(lèi)個(gè)體數(shù)較少的主要原因之一；另一個(gè)原因是水域面積太大，魚(yú)類(lèi)分布范圍廣，放流群體樣本被回捕的概率較小。此外，與很多研究報(bào)道中的幾百尾甚至上千尾的回捕樣本數(shù)量相比，本研究回捕樣本數(shù)量略顯不足。但是，本研究在選取回捕采樣點(diǎn)時(shí)，在位于兩座水電站中間的水域分別選取大港頭(近放流點(diǎn))、碧湖(中游段)和南明湖(下游段)3個(gè)采樣點(diǎn)，兼顧放流魚(yú)類(lèi)空間分布的同時(shí)，回收子代2年，也考慮了時(shí)間上的變化，在一定程度上彌補(bǔ)了回捕樣品數(shù)量偏少所造成的不足，降低了回捕樣品數(shù)量少對(duì)評(píng)估增殖放流貢獻(xiàn)率的影響。

目前，增殖放流效果評(píng)估的側(cè)重點(diǎn)多為對(duì)漁業(yè)資源量恢復(fù)的效果評(píng)估，而關(guān)于增殖放流人工群體對(duì)野生群體遺傳多樣性影響的評(píng)估有待于進(jìn)一步加強(qiáng)。研究表明，增殖放流存在一定的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，如增加群體基因流和遺傳同質(zhì)性，降低有效群體大小等[29-30]。Liu等[29]對(duì)在盤(pán)錦大量增殖放流的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)進(jìn)行了遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示，大規(guī)模的增殖放流對(duì)盤(pán)錦本地種群及遼東半島水域種群產(chǎn)生了較大的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。因此，在后續(xù)的研究中，建議在充分利用微衛(wèi)星基因型數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對(duì)放流群體和野生群體的長(zhǎng)期持續(xù)跟蹤，為唇魚(yú)骨增殖放流的科學(xué)評(píng)估和種質(zhì)資源保護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 小結(jié)

本研究利用10對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)唇魚(yú)骨增殖放流效果進(jìn)行評(píng)估，其累計(jì)親權(quán)排除率為0.999 999 62，推算出增殖放流的唇魚(yú)骨對(duì)甌江野生群體的貢獻(xiàn)率為2.91%。研究結(jié)果表明，甌江增殖放流的唇魚(yú)骨具有一定的資源恢復(fù)效果。此結(jié)果對(duì)其資源保護(hù)和后續(xù)開(kāi)展科學(xué)增殖放流具有重要指導(dǎo)意義。