棘頭梅童魚(yú)肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因克隆及組織表達(dá)分析

歐陽(yáng)文杰 宋煒 陳佳 桂福坤 程家驊 謝正麗 馮廣朋

(1 浙江海洋大學(xué)，國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022； 2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090； 3 福建福鼎海鷗水產(chǎn)食品有限公司，大黃魚(yú)育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建寧德 352103； 4 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院漁業(yè)機(jī)械儀器研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)裝備與工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs)屬于脂結(jié)合蛋白超家族成員，是一類分子量較小而對(duì)脂肪酸有高親和力的可溶性蛋白質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的腸道黏膜、肝臟、腎臟、心臟、肌肉、腦、脂肪組織等組織細(xì)胞中，其功能主要是參與細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝調(diào)節(jié)，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、機(jī)體免疫等[1-4]。自1972年首次發(fā)現(xiàn)該蛋白以來(lái)，根據(jù)被分離出的組織及其主要結(jié)構(gòu)，已鑒定出18種不同的脂肪酸結(jié)合蛋白[5-8]。不同類型的FABP基因序列之間具有較高的同源性，目前普遍認(rèn)為它們是由魚(yú)類和哺乳動(dòng)物分化之前的一個(gè)共同祖先進(jìn)化而來(lái)的[9]。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(liver fatty acid binding protein，L-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白家族的重要成員，對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFAs)有較高的親和力，可以介導(dǎo)脂肪酸由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到氧化和合成的部位，在LCFAs的代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。目前已在斑馬魚(yú)(Daniorerio)[11]、綠河鲀(Tetraodonnigroviridis)[12]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[14]和雀鱔(Lepisosteusoculatus)[15]等少數(shù)魚(yú)類中克隆得到L-FABP基因序列。研究表明，斑馬魚(yú)和綠河鲀的L-FABP基因主要在腸道中表達(dá)，草魚(yú)和虹鱒的L-FABP基因主要在肝臟中有表達(dá)，而雀鱔的L-FABP基因在心臟中的相對(duì)表達(dá)量最高。

棘頭梅童魚(yú)(Collichthyslucidus)隸屬于鱸形目(Perciformes)、石首魚(yú)科(Sciaenidae)、梅童魚(yú)屬(Collichthys)。該魚(yú)適溫、適鹽范圍廣，廣泛分布于我國(guó)近海和河口地區(qū)，是重要的小型底棲經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[16-17]。棘頭梅童魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，脂肪酸種類多樣，富含鮮味氨基酸，必需氨基酸組成合理，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[18]。目前，有關(guān)棘頭梅童魚(yú)的研究主要集中在形態(tài)分類[19-20]、早期發(fā)育[21-22]、遺傳結(jié)構(gòu)[23-24]和生化成分[25]等方面，尚未見(jiàn)關(guān)于該魚(yú)脂類營(yíng)養(yǎng)需求及其調(diào)控方面的報(bào)道。本研究克隆得到了棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的cDNA序列，進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)了其在不同組織中的表達(dá)特異性，以期為進(jìn)一步研究L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、脂肪酸代謝和免疫應(yīng)答等方面的功能提供基礎(chǔ)資料。

表1 棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因克隆和熒光定量PCR檢測(cè)所用引物

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用棘頭梅童魚(yú)為2021年9月9日從閩東海域采集的野生棘頭梅童魚(yú)，共16尾，平均體質(zhì)量為(20.36±11.98)g，平均體長(zhǎng)為(9.91±2.31)cm。解剖試驗(yàn)魚(yú)并取其不同組織(胃、鰓、肝臟、腸道、眼、大腦、心臟、肌肉、脾臟、頭腎和中腎)，放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，用于RNA提取。

1.2 RNA提取及cDNA合成

參照Trizol試劑(Beyotime)說(shuō)明書(shū)提取各組織樣本的總RNA。用微量分光光度計(jì)(BioTeke ND5000)檢測(cè)提取RNA樣品的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒(TOYOBO)合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)基因克隆和熒光定量(qRT-PCR)分析。

1.3 L-FABP基因克隆

以Gan等[17]全基因組測(cè)序組裝數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取墨西哥脂鯉(Astyanaxmexicanus)、斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)、綠河鲀、劍尾魚(yú)(Xiphophorushelleri)和大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)的L-FABP基因序列，進(jìn)行BLAST比對(duì)(10-10)，獲得棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的含開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)的cDNA序列。在L-FABPcDNA序列上、下游設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物(見(jiàn)表1)，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

用Vector NTI 11.5.1軟件預(yù)測(cè)棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的ORF，推測(cè)其編碼的氨基酸序列；使用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算氨基酸分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；利用InterProScan在線網(wǎng)站(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用在線工具UCL(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；用SignalP-5.0 Server在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)L-FABP的信號(hào)肽；采用Clustal X軟件對(duì)棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行多序列比對(duì)，并在MEGA 7軟件中，使用Maximum Likelihood method(最大似然估計(jì)法)的LG+G模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，設(shè)置Bootstrap為1 000。

注：方框內(nèi)為起始密碼子；*為終止密碼子；下劃線為脂質(zhì)/胞質(zhì)性脂肪酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域；灰色陰影為多聚腺苷酸化信號(hào)。

1.5 組織表達(dá)分析

L-FABP基因的特異性引物使用Primer Premier 5軟件及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)，β-actin作為內(nèi)參基因(見(jiàn)表1)。使用cDNA為模板，選擇TB Green?PremixExTaqTM(TaKaRa)作為定量反應(yīng)試劑，根據(jù)Bio-Rad CFX96TM型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL TB GreenPremixExTaq，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，6.8 μL ddH2O，上、下游引物各0.4 μL，2 μL 10倍稀釋后的cDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后60～95 ℃獲得熔解曲線并確認(rèn)擴(kuò)增引物的特異性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔΔCT方法測(cè)定不同組織中L-FABP基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Prism 8軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan’s法多重比較檢驗(yàn)組間差異的顯著性并繪圖，設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因序列

克隆得到棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的含ORF的cDNA序列為475 bp，其中5’-UTR(非翻譯區(qū))為51 bp，3’-UTR為40 bp，在3’-UTR區(qū)域能找到明顯的多腺苷酸化信號(hào)(PAS)AATAAA序列。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，ORF為384 bp，編碼127個(gè)氨基酸，分子量為13.90 kDa，等電點(diǎn)(pI)值為5.59，不穩(wěn)定系數(shù)(II)為22.51，判斷為穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)(AI)為87.32，總平均親水性(GRAVY)為-0.346。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，找到編碼蛋白在第3～126位點(diǎn)有脂質(zhì)/胞質(zhì)性脂肪酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1)。根據(jù)UCL和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)結(jié)果，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的氨基酸結(jié)構(gòu)由10個(gè)β-折疊鏈和2個(gè)α-螺旋鏈構(gòu)成(見(jiàn)圖2)。SignalP-5.0 Server的結(jié)果表明，在棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽(見(jiàn)圖3)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因氨基酸序列提交至NCBI，通過(guò)blastp比對(duì)氨基酸同源性。結(jié)果表明，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因氨基酸序列與大黃魚(yú)一致性最高，相似性為96.06%。與條紋狼鱸(Moronesaxatilis)、赤鋸鱗魚(yú)(Myripristismurdjan)、白梭吻鱸(Sanderlucioperca)等物種的一致性為92.13%(見(jiàn)表2)。使用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因氨基酸序列與其他物種相比，具有41個(gè)絕對(duì)保守位點(diǎn)(同一性100%)，其中賴氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)及蘇氨酸(Thr)出現(xiàn)的頻率最高(見(jiàn)圖4)。使用MEGA 7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因可與其他物種L-FABP基因聚類，與大黃魚(yú)有較高的同源性，置信度為81，而與綠河鲀的同源性較低(見(jiàn)圖5)。

2.3 L-FABP基因在不同組織的表達(dá)水平

L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)肝臟、腸道、眼、大腦、心臟、肌肉、胃、鰓、脾臟、頭腎和中腎共11個(gè)組織中均有表達(dá)(見(jiàn)圖6)，且存在組織表達(dá)差異性。棘頭梅童魚(yú)肝臟中的L-FABP基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織中的(P<0.05)，腸道、肌肉組織次之，頭腎、心臟、眼睛、鰓、胃和大腦中的L-FABP基因相對(duì)表達(dá)量較低，中腎和脾臟中的L-FABP基因相對(duì)表達(dá)量最低。

表2 棘頭梅童魚(yú)與其他物種同源L-FABP基因的相似性

3 討論

本研究成功克隆出棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的cDNA序列，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了分析，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因含有脂質(zhì)/胞質(zhì)性脂肪酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與魚(yú)類和其他水生無(wú)脊椎動(dòng)物FABPs中所發(fā)現(xiàn)的保守結(jié)構(gòu)域一致[26]。預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為10條反向平行的β-折疊鏈和2條短的α-螺旋鏈，符合傳統(tǒng)FABPs基因家族成員的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[27]。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的氨基酸序列與其他魚(yú)類相比，具有41個(gè)絕對(duì)保守位點(diǎn)，其中Lys、Gly、Thr出現(xiàn)的頻率最高，推測(cè)其可能與維持L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)進(jìn)化過(guò)程中的生物學(xué)功能穩(wěn)定有關(guān)。利用L-FABP進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，棘頭梅童魚(yú)與大黃魚(yú)(石首魚(yú)科)同源性很高，與淡水鯊魚(yú)、斑馬魚(yú)及尼羅羅非魚(yú)同源性僅為75%左右，符合傳統(tǒng)分類地位。

FABPs基因家族成員蛋白對(duì)脂肪酸有很高的親和力，在脂肪酸代謝過(guò)程中起著重要作用。其主要功能是在脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到不同的位點(diǎn)進(jìn)行代謝或者儲(chǔ)存，同時(shí)也參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和代謝，并通過(guò)參與脂類合成從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)分化。因此，F(xiàn)ABPs基因家族成員蛋白在各生物的不同組織，如肝臟、腸道、肌肉和心臟等廣泛分布。本研究主要針對(duì)棘頭梅童魚(yú)FABPs基因家族中的L-FABP基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP基因廣泛分布于多種組織中，與L-FABP基因在卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)組織中的表達(dá)模式相似[28]。肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用，且具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的功能，是機(jī)體能量代謝的重要環(huán)節(jié)[29]。在哺乳動(dòng)物中，L-FABP基因主要分布于肝臟、腸道、腎臟和胰腺中[30]。而L-FABP基因在不同魚(yú)類不同組織的分布差異較大，草魚(yú)的L-FABP基因在肝臟中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是后腸、脾臟和后腎，在前腸、中腸、心臟、頭腎、肌肉和鰓中的相對(duì)表達(dá)量較低[13]。虹鱒[14]和矛尾復(fù)蝦虎魚(yú)(Synechogobiushasta)[26]的L-FABP基因也是在肝臟中相對(duì)表達(dá)量最高。斑馬魚(yú)和綠河鲀的L-FABP基因主要在腸道中富集[11-12，31]。斑點(diǎn)雀鱔的L-FABP基因在心臟組織中相對(duì)表達(dá)量最高[15]。本研究中，L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)不同組織中的表達(dá)也存在差異，在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織中的(P<0.05)，說(shuō)明肝臟是棘頭梅童魚(yú)脂質(zhì)合成和脂肪水解的核心部位?；虻谋磉_(dá)功能與其在組織中的特異性表達(dá)緊密相關(guān)。脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)源性途徑(endogenous pathway)就是通過(guò)肝臟將合成的脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體其他組織貯藏或利用的過(guò)程，因此，肝臟是脂肪代謝的重要場(chǎng)所。根據(jù)棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因在肝臟中的高相對(duì)表達(dá)量可以推斷，肝臟參與合成大量的脂肪，為維持其穩(wěn)態(tài)，高含量的脂肪酸會(huì)促進(jìn)L-FABP基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯，從而將過(guò)多的脂肪酸運(yùn)出肝臟，或轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體中氧化分解。因此推測(cè)，L-FABP基因在參與棘頭梅童魚(yú)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，以及肝臟對(duì)脂肪酸的調(diào)節(jié)和代謝的過(guò)程中具有相關(guān)作用，該基因在肝臟中具體的生物學(xué)功能值得進(jìn)一步探究。L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)肌肉中的相對(duì)表達(dá)量也較高，推測(cè)原因，可能是棘頭梅童魚(yú)在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的肌肉舒張和收縮需要消耗大量的能量，從而促進(jìn)L-FABP蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸至線粒體進(jìn)行氧化分解，由此為機(jī)體供能；也有可能與本研究采集的棘頭梅童魚(yú)正處于性腺發(fā)育成熟期有關(guān)，說(shuō)明此階段棘頭梅童魚(yú)肌肉中脂代謝活動(dòng)旺盛。

注：標(biāo)注字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)。

4 結(jié)論

本研究克隆得到了棘頭梅童魚(yú)L-FABP基因的含ORF的cDNA序列，通過(guò)多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，證明該基因與其他魚(yú)類的肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因高度相似。L-FABP基因廣泛分布于棘頭梅童魚(yú)不同組織中，猜想L-FABP基因在棘頭梅童魚(yú)不同組織中均發(fā)揮作用，且在脂代謝途徑中發(fā)揮不同的功能作用，這為后期功能驗(yàn)證創(chuàng)造了條件。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)魚(yú)類脂肪酸結(jié)合蛋白，也為棘頭梅童魚(yú)營(yíng)養(yǎng)及免疫調(diào)控分子機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)資料。