彩虹明櫻蛤染色體制備及核型分析

馮森磊，任國梁，甘樹勝，梁夏菲，段海寶，葛紅星，董志國

( 江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室，江蘇 連云港 222005 )

彩虹明櫻蛤(Moerellairidescens)俗稱海瓜子，是沿海地區(qū)的一種經(jīng)濟貝類，屬簾蛤目櫻蛤科明櫻蛤?qū)?。因其個體大小和形狀與食用瓜子相似而得名。其味道鮮美，營養(yǎng)豐富[1]，主要分布于西太平洋沿岸和澳大利亞北部，在我國主要產(chǎn)于浙江和福建沿海等地[2]。

染色體是染色質(zhì)的一種形態(tài)，易被堿性染料染色，具有一定形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，它主要由DNA和蛋白質(zhì)組成，是遺傳信息的載體，具有儲存和傳遞遺傳信息的功能[3]。染色體作為細胞中重要的遺傳物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能一直是細胞遺傳學的重點研究內(nèi)容。核型是染色體在細胞有絲分裂中期的表型，能反映出染色體的數(shù)目、大小、形態(tài)等特征[4]。簾蛤目是雙殼貝類中的一個大類群，在我國常見的簾蛤目種類有60余種。據(jù)不完全統(tǒng)計，截至2014年，我國對軟體動物種類的染色體核型分析已報道81種，其中雙殼類52種，對簾蛤目染色體的研究有19種，其中簾蛤科9種，蛤蜊科4種，竹蟶科3種，刀蟶科2種，紫云蛤科1種[5]。段海寶等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青蛤(Cyclinasinensis)二倍體與單倍體數(shù)目分別是2n=38和n=19，核型組成為2n=11m+6sm+2st；楊品紅等[7]對三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的研究結(jié)果顯示，其染色體中的絕對長度較小，二倍體數(shù)目為2n=38，核型為2n=12m+5sm+2st，臂數(shù)為NF=72；蔡巖等[8]研究表明，法螺(Charoniatritonis)染色體二倍體數(shù)2n=70，核型為2n=32m+18sm+20st，NF=120。而有關(guān)櫻蛤科種類的染色體研究尚未見報道，筆者通過染色體制片獲得清晰的染色體分裂相，對彩虹明櫻蛤的染色體核型進行分析，探明其染色體數(shù)目及核型組成，有助于從染色體方面為彩虹明櫻蛤的遺傳生化的進一步研究提供理論依據(jù)，同時也可為彩虹明櫻蛤在貝類中的系統(tǒng)分類地位以及系統(tǒng)演化過程提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選自浙江寧波的彩虹明櫻蛤成貝，將彩虹明櫻蛤置于實驗室進行養(yǎng)殖，水體充氧，保持良好水質(zhì)，定期投喂微藻，以保證彩虹明櫻蛤的正常生理狀態(tài)。

1.2 試驗方法

參考文獻[9]的方法，并根據(jù)試驗中實際情況稍作改良，選取彩虹明櫻蛤成貝中的鰓瓣外緣組織作為材料，置于提前配制好的含有0.06%秋水仙素的過濾海水中，處理30 min。經(jīng)秋水仙素預(yù)處理后，通過溶液低滲40 min，加入8 mL配制好的預(yù)冷卡諾固定液[V(甲醇)∶V(冰乙酸)=3∶1]固定，反復(fù)固定3次，每次15 min，總固定時間為1 h，倒掉卡諾固定液，用鑷子將鰓組織移入1.5 mL離心管，加入1 mL的50%冰乙酸，制備細胞懸液，熱滴片法滴片，溫度為56 ℃，配制10%的吉姆薩染液[9∶1(體積比)]，染色30 min，自然晾干，鏡檢。

1.3 彩虹明櫻蛤染色體計數(shù)與核型分析

1.3.1 核型分析

選取分散好、形態(tài)完整的染色體中期分裂相，顯微拍照并利用Nikon NIS-Elements BR 3.1軟件測量染色體絕對長度。使用Office 2019進行數(shù)據(jù)整理，并計算相對長度和臂比。利用Photoshop軟件提取每條染色體，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。根據(jù)Levan等[10]提出的染色體分類標準進行染色體類型分類，然后進行配對，統(tǒng)計結(jié)果，繪制染色體核型圖。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

分類：根據(jù)臂比的大小可以確定染色體屬于哪種形態(tài)類型(表1)。

表1 染色體類型按臂比值分類

配對：根據(jù)測量數(shù)據(jù)，即染色體相對長度、臂比、染色體的性狀和大小等進行同源染色體的配對。

染色體臂數(shù)(NF)：m、sm、st類型的染色體臂數(shù)計為2，t類型的染色體臂數(shù)計為1。

相對長度為實測長度占全部染色體長度總和的百分比；臂比為長臂長度與短臂長度之比。

2 結(jié) 果

2.1 彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目

選取30個分裂相較好的中期分裂相染色體視野(圖1)，統(tǒng)計染色體的數(shù)目并計算其百分比。其中2n=36占比最高，為46.67%；2n=34占比為20.00%，而2n為其他數(shù)量的所占比例均<10%(表2)。試驗結(jié)果顯示，彩虹明櫻蛤染色體眾數(shù)為2n=36。

圖1 彩虹明櫻蛤中期分裂相染色體Fig.1 Metaphase chromosome of the clam M. iridescens

表2 彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目統(tǒng)計

2.2 彩虹明櫻蛤染色體核型分析

在彩虹明櫻蛤的染色體標本中，選取10個分散好、形態(tài)正常的染色體中期分裂相進行測量，計算其相對長度和臂比的結(jié)果(表3)，通過對比分析進行配對(圖2)。

表3 彩虹明櫻蛤染色體相對長度、臂比以及類型

圖2 彩虹明櫻蛤中期分裂相染色體及核型Fig.2 Metaphase chromosome and karyotype of the clam M. iridescensa.中期分裂相染色體； b.染色體核型.a.metaphase chromosomes； b.karyotype of chromosome.

通過比較總結(jié)得出，彩虹明櫻蛤的18對染色體中，有4對中著絲粒染色體(m)、8對亞中著絲粒染色體(sm)、6對亞端著絲粒染色體(st)。染色體核型為2n=8m+16sm+12st，NF=72，染色體總長度為83.10 μm，未發(fā)現(xiàn)性染色體和隨體。

3 討 論

3.1 貝類染色體制片

在制備染色體的過程中，有很多處理因素都可能會造成染色體不同程度的收縮，所測得的染色體長度往往不能真實反映染色體的長度特征，但各染色體的臂比和相對長度等，則能體現(xiàn)出染色體的特征[10-11]。利用Photoshop軟件進行圖像清晰化和摳圖處理，結(jié)合臂比和相對長度以及染色體形態(tài)等特征，進行同源染色體配對，可以得到較為清晰的染色體核型圖。目前制備貝類染色體的材料，大多采用的是貝類早期胚胎、生殖腺、擔輪幼蟲及鰓組織等[12]。蔡明夷等[13]選取波紋巴菲蛤(Paphiaundulata)擔輪幼蟲為材料，采用滴片法成功制出波紋巴非蛤的染色體，染色體數(shù)目為2n=38；周琳等[14]取魁蚶(Scapharcabroughtonii)孵化后的擔輪幼蟲為材料采用滴片法制出其染色體，染色體數(shù)目為2n=38；于瑞海等[15]選取活的等邊淺蛤(Macridiscusaequilatera)中鰓為組織材料，采用滴片法制取出染色體，染色體數(shù)目為2n=36；周麗青等[9]通過調(diào)節(jié)水溫，選取鰓絲及鰓絲對應(yīng)部位創(chuàng)面的愈合增生組織為材料，采用熱滴片法制出櫛江珧(Atrinapectinata)染色體，染色體數(shù)目為2n=34。以早期胚胎和擔輪幼蟲為材料可以更容易獲得染色體分裂相，這是因為此時細胞處于生長旺盛時期，分裂能力強，更容易看到染色體分裂相。但利用胚胎和擔輪幼蟲制備染色體，會受到季節(jié)的限制，而利用鰓組織則不受季節(jié)限制，細胞分裂會相對較少[15]。對于分裂相較少的情況，一般采用植物血球凝集素進行預(yù)處理，可以有效增加細胞分裂[16]。此外，利用鰓組織制備染色體成為了一種重要手段，并在多種貝類如紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)等貝類中取得了成功[17-18]。染色體制片的流程一般是預(yù)處理—低滲—固定—解離—滴片—染色，然后得到清晰的染色體分裂相。在本試驗中，以彩虹明櫻蛤成貝鰓組織為材料，制備染色體標本，分別采用0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 4個不同質(zhì)量分數(shù)梯度的秋水仙素溶液處理鰓組織，處理時間為40 min。從制片效果看，以質(zhì)量分數(shù)0.06%最適，質(zhì)量分數(shù)0.02%、0.04%處理的染色體分裂相少，質(zhì)量分數(shù)0.08%處理的染色體收縮、聚集、分散不好，無法計數(shù)，而在0.065 mol/L KCl溶液下處理40 min低滲效果最佳，0.045 mol/L KCl溶液低滲效果不理想，細胞形態(tài)易發(fā)生畸形。預(yù)試驗結(jié)果表明，秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的高低和處理時間的長短都會影響到染色體形態(tài)，低滲時間過短會導(dǎo)致細胞形態(tài)發(fā)生畸形，過長則會導(dǎo)致細胞膜破裂，導(dǎo)致染色體丟失。

3.2 彩虹明櫻蛤染色體核型特征及其進化規(guī)律

本試驗表明，彩虹明櫻蛤的染色體數(shù)目為2n=36，這與等邊淺蛤的染色體數(shù)目相同[15]，而與大多數(shù)的簾蛤目種類染色體數(shù)目不同，簾蛤目種類染色體數(shù)目大多為2n=38[5]。從染色體數(shù)目來看，彩虹明櫻蛤和等邊淺蛤(2n=36)有著較親密的親緣關(guān)系。Nakamura等[19-20]認為，原始雙殼貝類染色體數(shù)目可能是2n=38。貝類在核型進化過程中，主要有兩個方向，一個是染色體數(shù)目的增加，一個是染色體數(shù)目的減少。目前相關(guān)研究表明，雙殼貝類染色體數(shù)目減少是比較常見的類型，比如大獺蛤(Lutrariamaxima)和中國紫蛤(Sanguinolariachinensis)的染色體數(shù)目分別為34和30條[21-22]，而有關(guān)染色體數(shù)目增加的種類還未有報道。已知的簾蛤目染色體數(shù)目多為2n=38，而2n=30或2n=34可能是進化過程中染色體數(shù)目減少的類型，2n=36可能是進化過程中的中間過渡類型[5]。筆者制備染色體的材料是成體鰓組織，在得出的染色體分裂相中，存在少于正常條數(shù)的染色體數(shù)目，這可能是由于在制片過程中出現(xiàn)染色體丟失或者聚集等情況。同時，有絲分裂發(fā)生異常也會造成非整數(shù)倍體等異常現(xiàn)象，導(dǎo)致所得到的分裂相與正常染色體數(shù)目不同。本試驗結(jié)果顯示，在彩虹明櫻蛤的18對同源染色體中，有4對為中著絲粒染色體(m)，8對為亞中著絲粒染色體(sm)，6對亞端著絲粒染色體(st)，m和sm類型染色體占2/3。這與大多數(shù)貝類的染色體核型組成相似，以m和sm類型染色體為主[5]，Ahmed[23]研究表明，m和sm染色體組型一般具有穩(wěn)定性，而t和st染色體較多變。在彩虹明櫻蛤的染色體中，中部和亞中部比值是：m/sm=4/8，因此在櫻蛤科中彩虹明櫻蛤的染色體進化過程比較保守，表明其有穩(wěn)定的細胞學特征。m/sm著絲粒染色體核型比例比st/t型更高時，生物進化程度更為高級或特化[24]。同時比較彩虹明櫻蛤和縊蟶(Sinonovaculaconstricta)中的染色體組型發(fā)現(xiàn)[23]，彩虹明櫻蛤沒有端部著絲染色體，其可能比縊蟶進化程度更為高級。然而，對文蛤(Meretrixmeretrix)染色體的研究發(fā)現(xiàn)，文蛤沒有t或st型[25-26]，表明文蛤可能比彩虹明櫻蛤進化程度更為高級。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，彩虹明櫻蛤染色體數(shù)目為2n=36，染色體核型公式為2n=8m+16sm+12st，未發(fā)現(xiàn)性染色體和隨體。從制片效果來看，選取繁殖前期具有較強分裂能力的彩虹明櫻蛤鰓組織作為制備染色體材料，采用質(zhì)量分數(shù)0.06%的秋水仙素進行預(yù)處理40 min，0.065 mol/L的KCl溶液低滲40 min，更易獲得清晰的中期染色體分裂相。