銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞生殖及抗氧化酶的影響

邢 浩，陳桃英，段元亮，郜曉峰，劉 煒，鐘逸云，張建琳， 常佳楠，孫 彬，何培民

( 1.上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，水域環(huán)境生態(tài)上海高校工程研究中心，上海 201306; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，水域生態(tài)學(xué)實驗室，上海 201306 )

近年來，隨著水體污染的加劇，微囊藻水華成為國內(nèi)外廣泛關(guān)注的話題[1]。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)通常是藍藻水華暴發(fā)的優(yōu)勢種，在富營養(yǎng)化水體中能夠快速繁殖。楊娜等[2]發(fā)現(xiàn)，在杭州灣金山城市沙灘低鹽度封閉海域存在銅綠微囊藻，夏季微囊藻成為當?shù)貎?yōu)勢種，暴發(fā)時藻密度可超過1×107個/mL。這一現(xiàn)象不僅破壞了水體的生物多樣性和水域生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還影響了當?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展；并且微囊藻會產(chǎn)生藻毒素，其毒性會影響浮游動物的生長和繁殖[3]。而枝角類動物作為水體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是維持水體生態(tài)系統(tǒng)平衡和能量流動的重要環(huán)節(jié)，在水體中通常扮演初級消費者的角色[4]。環(huán)境因子對枝角類動物生活史的影響已有研究[5-6]，戴曦等[7-9]也做了大量微囊藻對淡水枝角類生活史特征影響的研究，但在低鹽度封閉海域水體生態(tài)系統(tǒng)中微囊藻與浮游動物之間的生態(tài)關(guān)系尚未見報道。

微囊藻毒素的釋放會對浮游動物的種群增長、生長繁殖、生理功能產(chǎn)生影響，微囊藻毒素會改變環(huán)境中動物體內(nèi)氧化還原的穩(wěn)定狀態(tài)，并產(chǎn)生引起細胞氧化壓力以及損害DNA和蛋白結(jié)構(gòu)的活性氧[10]，所以抗氧化防御系統(tǒng)在動物體內(nèi)占據(jù)著重要地位。目前納米材料和重金屬對枝角類動物抗氧化防御的影響研究較多[11-12]。對于鹽水枝角類抗氧化系統(tǒng)在微囊藻毒素脅迫下的研究，既可以豐富水生動物生理學(xué)，又能反映水環(huán)境中微囊藻毒素的存在對于生態(tài)環(huán)境污染監(jiān)測的作用。

蒙古裸腹溞(Moinamongolica)是一種廣鹽廣溫的枝角類動物，它具有生長周期短、繁殖迅速、營養(yǎng)價值高、易培養(yǎng)、可塑性高、對環(huán)境變化敏感等優(yōu)勢，因此可作為潛在的毒性測試受試動物[13]。關(guān)于它的研究集中在其對有機污染物和重金屬毒性測試方面[14-16]。因此，筆者選取蒙古裸腹溞作為受試生物，旨在探討有毒銅綠微囊藻對鹽水枝角類的生長繁殖以及氧化還原效應(yīng)的影響，以此來評估藍藻水華的生態(tài)風險，為后續(xù)的富營養(yǎng)化的河口區(qū)、濱海區(qū)的藍藻水華治理工作提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

有毒銅綠微囊藻(M.aeruginosa) FACHB 905購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，室內(nèi)顯微鏡觀察為單細胞藻種。藻種在無菌條件下利用BG-11培養(yǎng)基接種擴培，于溫度(25±1) ℃、光照度3000 lx、光暗比12 h∶12 h、鹽度8、pH 7.2的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每日定時搖晃3次，及時鏡檢藻種的生長情況，試驗選擇對數(shù)期生長后的藻種。海水小球藻(Chlorellasp.)使用f/2培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件與有毒銅綠微囊藻一致。

蒙古裸腹溞為采自晉南硝池，于上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院水域生態(tài)學(xué)實驗室經(jīng)數(shù)十年培養(yǎng)而保存下來的溞種。試驗開始前4個月將溞種馴養(yǎng)在鹽度8(自來水和鹽鹵配制而成，使用前經(jīng)過濾、煮沸)、溫度21～28 ℃的半咸水中，以小球藻為餌長期培養(yǎng)。試驗中的蒙古裸腹溞是由同一母體繁殖3代以上的1 d幼齡期的健康幼溞。

動物組織中氧化還原酶(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性)的測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行。

1.2 試驗條件

試驗用經(jīng)過濾、煮沸的鹽鹵和自來水配制而成的海水將有毒銅綠微囊藻藻液稀釋成不同藻密度，所有試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，溫度25 ℃、光照度3000 lx、光暗比12 h∶12 h、鹽度8，試驗中所用容器為150 mL燒杯。細胞計數(shù)是通過將有毒銅綠微囊藻和小球藻的藻液分別稀釋成不同倍數(shù)，使用紫外分光光度計測量在680 nm時的吸光值，在顯微鏡下使用XB-K-25型血球計數(shù)板對藻細胞數(shù)目進行計數(shù)，進而建立藻細胞數(shù)目與680 nm吸光值之間的線性關(guān)系，得出單位體積的藻細胞數(shù)，用來表示2種藻的藻液密度。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 有毒銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞生活史影響試驗

依據(jù)預(yù)試驗致死密度范圍，設(shè)置1×105、1×106、1×107、5×107個/mL 4個有毒銅綠微囊藻處理組、對照組(小球藻)和禁食組(無餌料)。由于小球藻是蒙古裸腹溞的天然餌料，作為對照組。藻密度設(shè)為3×106個/mL，此密度為蒙古裸腹溞的最適培養(yǎng)密度。每個處理設(shè)3個平行，挑選20只健康新生幼溞放入裝有100 mL試驗水樣的燒杯里。每日記錄蒙古裸腹溞死亡個數(shù)及產(chǎn)幼量(將母體與新生幼體分離，并將新生幼體移出燒杯)。試驗以燒杯中的蒙古裸腹溞全部死亡結(jié)束。

1.3.2 混合投喂有毒銅綠微囊藻與小球藻對蒙古裸腹溞生活史影響試驗

將有毒銅綠微囊藻與小球藻按一定比例搭配(表1)。每個處理組3個平行。選擇新生幼溞放入裝有100 mL試驗水樣的燒杯中，每個燒杯中放置20只，試驗過程中，每日更換藻液1次，記錄存活數(shù)量、首次產(chǎn)幼時間、產(chǎn)幼數(shù)量、最后產(chǎn)幼時間。燒杯中的動物全部死亡時，試驗結(jié)束。

表1 混合投喂試驗中不同處理組的藻類組合

1.3.3 酶活性測定試驗

將有毒銅綠微囊藻與小球藻按一定比例搭配(表2)。設(shè)置1個對照組(小球藻)和2個處理組(混合餌料組、有毒銅綠微囊藻組)，每個處理設(shè)置3個平行，挑選新生幼溞放入1 L試驗水樣的燒杯中，每個燒杯中放置1000只，試驗共進行96 h。每隔24 h 挑出存活的幼溞使用生理鹽水反復(fù)洗滌去除動物身上的藻液雜質(zhì)，放在濾紙吸干水分，然后稱取組織質(zhì)量后，加入9倍體積的生理鹽水，用研磨棒充分勻漿，將制備好的組織勻漿液用高速冷凍離心機4 ℃、3000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min，離心后取上清液測定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性。

表2 酶活性測定試驗中不同處理組的藻類組合

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗記錄編制蒙古裸腹溞的生命表，計算凈生殖率(R0)、世代時間(T，d)、內(nèi)稟增長率(rm)[17]，其中：

T=∑x×lx×mx/∑lx×mx

(1)

R0=∑lx×mx

(2)

rm=lnR0/T

(3)

式中，x為日齡，lx為x齡蒙古裸腹溞的存活率(%)，mx為x齡蒙古裸腹溞的生殖率(%)。

試驗數(shù)據(jù)用Prism 7.04軟件進行繪圖，用 SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同藻密度的有毒銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞生長繁殖的影響

在不同藻密度的有毒銅綠微囊藻處理組中，蒙古裸腹溞的存活率隨著藻密度的提高而不斷降低，且幼溞最大壽命不超過6 d。高密度處理組(5×107個/mL)幼溞在第2天死亡，而對照組中幼溞的最大存活時間一直顯著高于其他處理組(df=5,F=1494.08,P=2.49×10-16)，幼溞在第34天全體死亡(圖1)。禁食組的壽命高于有毒銅綠微囊藻處理組，且試驗結(jié)果顯示，蒙古裸腹溞在單一有毒銅綠微囊藻處理組和禁食組的生殖率均為0。

2.2 有毒銅綠微囊藻與小球藻混合投喂對蒙古裸腹溞生長繁殖的影響

在100%小球藻處理組中，幼溞在試驗結(jié)束時的存活時間明顯高于其他處理組，為34 d(F=86.00, df=4,P=1.77×10-10)。100%有毒銅綠微囊藻處理組中幼溞存活率一直低于其他處理組，且在第8 天全部死亡。而在其他混合餌料組中，小球藻藻密度占比越大，蒙古裸腹溞的壽命越長(圖2)。

圖1 不同密度銅綠微囊藻下的蒙古裸腹溞的存活率Fig.1 The survival rate of water fleas M. mongolica exposed to different densities of M. aeruginosa

圖2 混合餌料不同處理組下蒙古裸腹溞的存活率Fig.2 The survival rate of water fleas M. mongolica in different treatment groups

在混合餌料下，各處理組的首次產(chǎn)幼時間均在第4 天(表3)，在整個試驗期間，100%小球藻組的首次產(chǎn)幼數(shù)量、最后產(chǎn)幼時間、產(chǎn)幼總數(shù)、平均產(chǎn)幼量顯著高于其他處理組(F=391.79, df=3,P=5.13×10-9；F=193.50, df=3,P=8.36×10-8；F=18 399.26, df=3,P=1.09×10-15；F=18 399.26, df=3,P=1.09×10-15)，并且首次產(chǎn)幼數(shù)量、產(chǎn)幼總數(shù)和平均產(chǎn)幼量均隨有毒銅綠微囊藻占比增高而減少。

表3 混合餌料下各處理組蒙古裸腹溞的種群增長參數(shù)

5個處理組中，100%小球藻組的凈生殖率、世代時間和內(nèi)稟增長率顯著高于其他處理組(F=375 714.96, df=4,P=7.83×10-26；F=299 928.74, df=4,P=2.41×10-25；F=578.64, df=4,P=8.81×10-12)。蒙古裸腹溞在100%銅綠微囊藻組的凈生殖率、世代時間以及內(nèi)稟增長率均為0。而在其他3個處理組中蒙古裸腹溞的凈生殖率和世代時間隨銅綠微囊藻密度上升而降低，3個處理組的內(nèi)稟增長率差異不顯著(F=1.617,df=2,P=0.27)。

表4 混合餌料不同處理組下蒙古裸腹溞種群增長參數(shù)

2.3 不同食物條件下蒙古裸腹溞體內(nèi)抗氧化酶活性變化

96 h內(nèi)攝食單一銅綠微囊藻以及混合餌料，蒙古裸腹溞體內(nèi)的超氧化物歧化酶活性不斷降低(圖3)。與小球藻組(對照組)相比，其中在48、96 h時，有毒銅綠微囊藻組的超氧化物歧化酶活性降低46%、48%(F=236.88,df=1,P=1.04×10-4；F=316.53,df=1,P=5.90×10-5)。而混合餌料組的超氧化物歧化酶活性一直高于有毒銅綠微囊藻組。在48 h后混合餌料組的超氧化物歧化酶活性下降趨于穩(wěn)定，而有毒銅綠微囊藻組在后期呈下降趨勢。

圖3 不同食物條件下蒙古裸腹溞體內(nèi)超氧化物歧化酶活性變化Fig.3 Changes in superoxide dismutase activity in water fleas M. mongolica under different food conditions不同處理組中標有不同小寫字母表示組間有顯著差異(P<0.05)，標有同一小寫字母表示組間無顯著差異(P>0.05)；下同.Means with different letters are significant differences between groups (P<0.05), and means with same letter are not significant differences between groups (P>0.05); et sequentia.

24 h時，小球藻組與混合餌料組、有毒銅綠微囊藻組的過氧化氫酶活性差異顯著(F=37.95, df=2,P=3.93×10-4)(圖4)，混合餌料組中過氧化氫酶活性高于小球藻組，有毒銅綠微囊藻組的過氧化氫酶活性最低。與小球藻組相比，混合餌料組的過氧化氫酶活性下降幅度變大。96 h內(nèi)，小球藻組的過氧化氫酶活性總體呈不斷上升的趨勢，而在48 h后混合餌料組的過氧化氫酶活性低于小球藻組，并隨時間不斷下降。

圖4 不同食物條件下蒙古裸腹溞體內(nèi)過氧化物酶活性變化Fig.4 Changes in catalase activity in water fleas M. mongolica under different food conditions

3 討 論

3.1 銅綠微囊藻的毒性對蒙古裸腹溞生長的抑制作用

銅綠微囊藻在野外環(huán)境聚集成團，以群體形式存在，但在室內(nèi)純種培養(yǎng)為單細胞，且蒙古裸腹溞是濾食性動物，排除了銅綠微囊藻因群體過大無法濾食的可能。多種水生生物的研究已證明，微囊藻毒素可以在浮游動物、甲殼類、雙殼類以及魚類生物體內(nèi)積累，甚至在某些水生脊椎動物體內(nèi)積累[18-19]。微囊藻毒素是一種肝毒素，它對水生動物的肝臟、消化器官具有損傷作用[20-21]。本試驗中，在不同藻密度的有毒銅綠微囊藻條件下，銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞生長的毒害作用是不同的。隨著銅綠微囊藻藻密度增加，其毒性作用增強，并且檢測到試驗中高密度到低密度的銅綠微囊藻胞外毒素MC-LR分別為150.00、12.00、1.40、0.15 μg/L，隨著時間的推移，釋放的毒素在動物體內(nèi)累積，這是銅綠微囊藻抗牧食的本能應(yīng)激反應(yīng)，然而這種行為會影響蒙古裸腹溞的濾食，不利于蒙古裸腹溞長期生長，會造成蒙古裸腹溞死亡率提高，懷卵困難，且試驗過程無繁殖現(xiàn)象。徐鑫李等[22]在研究大型溞與銅綠微囊藻的相互影響中發(fā)現(xiàn)，水體中銅綠微囊藻分泌的胞外藻毒素，以及被濾食消化后釋放的胞內(nèi)藻毒素均對大型溞具有毒性影響，并且微囊藻胞內(nèi)毒素的影響大于其釋放在水環(huán)境中的胞外藻毒素。據(jù)相關(guān)研究報道，微囊藻毒素可通過抑制特定的蛋白磷酸化，使自由和共價相互作用發(fā)生，從而影響浮游動物的存活、生長和繁殖[23]。

Asselman等[24]在探討大型溞與有毒微囊藻的生態(tài)關(guān)系時觀察到，微囊藻的毒害作用與微囊藻密度以及大型溞數(shù)量密切相關(guān)。Shahmohamadloo等[25]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示銅綠微囊藻產(chǎn)生的微囊藻毒素對大型溞具有亞致死作用，毒素越強，大型溞的死亡率越高。這與本試驗的結(jié)果相似。筆者也發(fā)現(xiàn)，相對于有毒銅綠微囊藻的存在，在禁食條件下的蒙古裸腹溞存活時間較長。一方面反映了有毒銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞具有較嚴重的毒害作用，另一方面蒙古裸腹溞可能也會濾食水體中的有機碎屑和懸浮物，在無其他食物的條件下，又能展示出它對惡劣環(huán)境的耐受性。因此，筆者認為微囊藻毒素可能是影響蒙古裸腹溞生長繁殖的重要原因。

3.2 混合餌料對蒙古裸腹溞生長繁殖的影響

枝角類一般為廣譜性牧食者，即對食物可食性不具有區(qū)分濾食的能力，當食物中含有產(chǎn)毒藍藻(單細胞)，枝角類只能降低攝食強度(如減少吞咽)，減少有毒藻的攝入，但這種方式也會造成其無法吸收其他重要營養(yǎng)物質(zhì)，這可能會引起枝角類營養(yǎng)攝取不足[26]。相關(guān)研究表明，在可食性綠藻食物投喂的條件下，也能緩解微囊藻對枝角類動物的毒害作用。與小球藻混合，單細胞有毒的銅綠微囊藻可被中華溞(Daphniasinensis)利用，改善其生活史特征[27-28]。這與本試驗結(jié)果相一致。本試驗中，在有毒銅綠微囊藻存在的條件下，小球藻所占的食物比重越高，蒙古裸腹溞存活時間越長，繁殖能力越好，由此更好地維持蒙古裸腹溞生命的活動。

內(nèi)稟增長率是判斷種群增長潛力的重要參數(shù)。在單一銅綠微囊藻的環(huán)境下，蒙古裸腹溞喪失繁殖能力，這也從側(cè)面反映有毒銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞的繁殖具有顯著的負面影響。在其他食物條件下，蒙古裸腹溞首次產(chǎn)幼時間均一致，可能與設(shè)置食物密度較低有關(guān)。單一小球藻和小球藻占比高的處理組的內(nèi)稟增長率高于其他組，表明蒙古裸腹溞在優(yōu)質(zhì)食物和優(yōu)質(zhì)食物占比高的條件下具有較高的種群增長潛力。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，長期生長在微囊藻占優(yōu)勢的湖泊中的一些小型枝角類，對微囊藻具有較好的適應(yīng)性，從而減弱了微囊藻對其毒害作用[29-30]。在本試驗中，銅綠微囊藻密度占比高的處理組也有較好的內(nèi)稟增長率，可能與蒙古裸腹溞在經(jīng)受微囊藻毒素一段時間的干擾從而對毒素產(chǎn)生抗性有關(guān)。因此，可以推測蒙古裸腹溞在面對產(chǎn)毒藍藻的脅迫時能產(chǎn)生快速適應(yīng)的集中表現(xiàn)可能是生長和繁殖能力的提高。

3.3 有毒銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞抗氧化酶的影響

在抗氧化酶中，去除活性氧的主要是過氧化氫酶，其通過去除過氧化氫減少組織損傷[34]。在試驗中混合藻液可誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生以及增強過氧化氫酶的清除能力，導(dǎo)致過氧化氫酶活性增加。過氧化氫酶活性在初期小球藻和有毒微囊藻混合液中顯著增加，在后期緩慢下降。主要原因是綠藻中抗氧化劑類胡蘿卜素增加了過氧化氫酶的活性[35]。后期酶活性下降是微囊藻的毒性作用增強所致，可能會降低過氧化氫酶去除活性氧的效率。

4 結(jié) 論

(1)通過室內(nèi)模擬，證實有毒銅綠微囊藻在低鹽度水生態(tài)系統(tǒng)對蒙古裸腹溞具有較強的毒害作用。表現(xiàn)在抑制蒙古裸腹溞生長繁殖，使其壽命減短且無繁殖情況。而蒙古裸腹溞作為鹽水枝角類毒性測試的模式生物，進一步延伸到藍藻暴發(fā)的階段，預(yù)測微囊藻的毒性作用可能會對水域內(nèi)浮游動物的生長繁殖產(chǎn)生不利影響。

(2)在兩種食物條件下，添加小球藻，可以緩解銅綠微囊藻對蒙古裸腹溞的毒害作用，且隨著有毒銅綠微囊藻占比的下降，凈生殖率和世代時間顯著上升，但內(nèi)稟增長率差異不顯著，這可能與蒙古裸腹溞對微囊藻毒素的抗性有關(guān)。

(3)通過對微囊藻毒素脅迫下的96 h蒙古裸腹溞的抗氧化酶效應(yīng)的研究，與小球藻組相比，暴露在有毒銅綠微囊藻的蒙古裸腹溞的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性下降，銅綠微囊藻抑制其生長。