注射用去甲斑蝥酸鈉中甘露醇的含量測定

祝 晶，王 璐，何劼毅，漆欣筑

(貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004)

0 引言

去甲斑蝥酸鈉是斑蝥素的衍生物之一，是由斑蝥素在堿性條件下制得斑蝥酸鈉后，去掉3，4位的2個甲基后得到的化合物。去甲斑蝥酸鈉腎毒性和對泌尿系統(tǒng)的刺激明顯減輕，而抗癌活性則顯著高于斑蝥素，此外還具有較好的升高白細胞及免疫調(diào)節(jié)的作用，對正常肝細胞有較好的保護作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥酸鈉對肝癌[2]，肺癌[3]，非小細胞癌[4]，鼻咽癌[5]療效確切，臨床已作為抗腫瘤的常規(guī)用藥。目前國內(nèi)其制劑有注射用去甲斑蝥酸鈉、去甲斑蝥酸鈉注射液及去甲斑蝥酸鈉氯化鈉注射液。

甘露醇(Mannitol)又稱D-甘露糖醇，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，分子式C6H14O6，分子量182.17。由于甘露醇穩(wěn)定性較好，且在人體內(nèi)代謝與體內(nèi)胰島素?zé)o關(guān)，不是口腔微生物作用的適合底物而不致齲齒，因而廣泛用于食品、醫(yī)藥行業(yè)。作為原料，甘露醇可用做脫水藥和滲透性利尿藥，其注射劑用于降低顱內(nèi)壓和眼內(nèi)壓，利尿，早期腎功能不全，腦水腫與青光眼及燒傷休克等并發(fā)的急性腎功能不全等[6]。作為藥用輔料，由于其具有抗粘性，可壓性，造料性較好，甘露醇常用于藥品片劑的填充劑、潤滑劑，也在凍干制劑中用作保護劑，賦形劑，其制得的凍干粉針飽滿、疏松，常優(yōu)選于其他賦形劑如乳糖、蔗糖、葡萄糖等[7-9]。但甘露醇也有一些列不良反應(yīng)，多次靜脈注射甘露醇，不僅對于穿刺局部，而且對于鄰近的血管及其周圍組織也具有更明顯的損害作用，在接受靜脈輸液的病人中，大概率出現(xiàn)程度不同的靜脈炎[10]。其利尿作用增加腎臟能量需求, 同時增加了急性腎衰(ARF)發(fā)生的機率，嚴(yán)重者發(fā)展為尿毒癥[11]，還可能引起過敏性休克，致神經(jīng)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，循環(huán)系統(tǒng)受到損傷[12]。查閱相關(guān)文獻，甘露醇每次使用劑量不宜超過100 g，每天總量不宜超過300 g，每日尿量少于1 500 mL的患者要慎用[13]。

本次抽驗涉及到2個廠家(廠家A，B)生產(chǎn)的注射用去甲斑蝥酸鈉3批次(A1、B1、B2)，執(zhí)行2個檢驗標(biāo)準(zhǔn)[14-15]。經(jīng)調(diào)研，2個廠家生產(chǎn)的注射用去甲斑蝥酸鈉均選用甘露醇作為輔料，處方中甘露醇的使用比例不同(收集到B廠家的處方量，甘露醇加入量為95%)，且均未對甘露醇進行含量控制?？紤]甘露醇可能會帶來的不良反應(yīng)，因此，對各廠家樣品中所含的甘露醇進行測定，有效控制注射用去甲斑蝥酸鈉中甘露醇的含量是十分有必要的。甘露醇屬于六元醇極性化合物，自身沒有紫外吸收，在常規(guī)的C18柱上幾乎無保留。查閱相關(guān)文獻，目前對于甘露醇定量分析的方法也多為高效液相色譜-示差折光檢測法(HPLC-RID)，色譜柱選用強離子鈣型交換柱，此方法專屬性較好，適用于復(fù)雜體系中甘露醇含量的測定，專屬性好，準(zhǔn)確度靈敏度高[16-17]。因此，本實驗建立HPLC-RID法測定注射用去甲斑蝥酸鈉中甘露醇含量，并進行方法學(xué)考察，為該品種的輔料用量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(Ultimate 3000)，示差折光檢測器(Thermo SHOKO)；XS-205型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)、超聲儀(型號：KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)、純水機(UPL-I-30EZ，四川優(yōu)普超純科技有限公司)；色譜柱：Carbomix Ca-NP10：8%(7.8 mm×300 mm，10 μm，柱號：251008-7830)。

1.1.2 實驗試劑與試藥

甘露醇對照品(100533-201103，中檢院，98.5%)，自制超純水，注射用去甲斑蝥酸鈉3批次(A廠家1批次，編號A1；B廠家2批次，編號B1、B2)，規(guī)格：10 mg/瓶。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物為填充劑的強離子鈣型交換柱，以水為流動相，流速0.5 mL/min，柱溫80 ℃，示差折光檢測器，檢測溫度為55 ℃，測定效果良好。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取甘露醇對照品50.0 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取樣品(編號B2)適量，置50 mL量瓶中，加適量水超聲溶解，稀釋成1 mL含甘露醇約5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 陰性溶液的制備

按注射用去甲斑蝥酸鈉的處方制備不含甘露醇的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法同法制備，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取上述對照品溶液，供試品溶液及陰性溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。陰性樣品未見吸收峰，無干擾。供試品中甘露醇峰的保留時間與對照品溶液中甘露醇峰的保留時間一致。甘露醇峰與相鄰峰的分離度達到要求，理論板數(shù)按甘露醇峰計不低于3 000，見圖1所示。

圖1 甘露醇對照品(A)、注射用去甲斑蝥酸鈉供試品(B)和陰性樣品(C)的HPLC-RID色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下的甘露醇對照品溶液10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL和50 μL(對應(yīng)分別含甘露醇0.049 36 mg、0.074 04 mg、0.098 70 mg、0.123 4 mg、0.148 1 mg和0.246 8 mg)注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜圖。并以對照品的量(mg)為橫坐標(biāo),峰面積的值為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。得回歸方程y=0.003 5x+0.000 3，r=0.999 9。結(jié)果表明甘露醇在0.049 36～0.246 8 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下的甘露醇對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，測定峰面積，峰面積RSD為0.19%，說明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗

按“2.2.2”項下的方法，平行制備6份供試品(編號1至6)，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，計算甘露醇的含量(mg/g)，平均含量為954.20 mg/g，6份供試品含量的RSD為0.30%，重復(fù)性結(jié)果良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.3”項下的供試品1，在室溫下每0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h和24 h，各精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，峰面積的RSD為0.35%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗

精密稱取甘露醇對照品約500 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密稱量本品適量(相當(dāng)于含甘露醇60 mg、 50 mg、40 mg)，分別置10 mL量瓶中，高濃度精密加入對照品貯備溶液6 mL、中濃度精密加入對照品貯備溶液5 mL、低濃度精密加入對照品貯備溶液4 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得高、中、低3個濃度供試品共9份，各精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，計算回收率為：98.47%、100.49%、99.72%、100.15%、99.27%、98.89%、98.84%、99.39%、98.82%，平均回收率為99.34%，RSD為0.68%，回收率結(jié)果良好。

2.3.6 檢出限與定量限的測定

精密稱取甘露醇對照品適量，配成不同濃度樣品按上述色譜條件進行測定，得到甘露醇的檢出限為6.734 8 ng，定量限為20.204 3 ng。

2.4 樣品含量測定

按上述實驗方法和色譜條件對3個批次的樣品進行含量測定，A廠家的樣品A1平均含量為345.748 5 mg/g(裝量0.2 g)，B廠家的樣品B1，B2的含量分別為952.522 5 mg/g及954.189 6 mg/g(裝量0.3 g)。廠家B含量測定結(jié)果與處方量基本一致且批次間控制較好。雖未收集到廠家A的處方，但從結(jié)果可以看出，因處方和工藝不同，兩個廠家甘露醇的實測量有較大的差異。

3 結(jié)果與討論

1)注射用去甲斑蝥酸鈉中的輔料為氫氧化鈉和甘露醇，根據(jù)調(diào)研提示加入過量氫氧化鈉的目的是與去甲斑蝥素反應(yīng)生成目標(biāo)主藥去甲斑蝥素鈉，再加入鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)配液罐中的pH值，所以去甲斑蝥素鈉的主要輔料是甘露醇。根據(jù)查閱文獻和藥典規(guī)定，建立注射用去甲斑蝥素鈉中甘露醇的檢驗方法，目的在于對此類藥品中的甘露醇進行用量控制。

2)在試驗中所檢測到的3批樣品，A1測定結(jié)果為345.748 5 mg/g，B1、B2測定結(jié)果為952.522 5 mg/g和954.189 6 mg/g，注射用去甲斑蝥酸鈉的每日最大使用劑量均為60 mg(6支)，按每日最大使用量計算按甘露醇的每日最大用量為0.4 g至2 g之間，甘露醇每次使用劑量不宜超過100 g，每天總量不宜超過300 g，2個廠家樣品中的甘露醇雖然沒有超過引起不良反應(yīng)的計量，但此產(chǎn)品的目標(biāo)使用者多為癌癥病人，其身體已經(jīng)非常虛弱，所以應(yīng)盡量減少藥物中的其他成分的不良反應(yīng)帶來的傷害。且各廠家的甘露醇用量存在較大差異，因此還是有必要對甘露醇進行合理控制，完善注射用去甲斑蝥酸鈉的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，從而提高注射用去甲斑蝥酸鈉的整體質(zhì)量。

3)本實驗建立了HPLC-RID方法，此方法專屬性強，準(zhǔn)確度較高，精密度及穩(wěn)定性良好，可用作注射用斑蝥酸鈉中輔料甘露醇的含量測定方法，為以后提高和完善注射用斑蝥酸鈉的檢驗標(biāo)準(zhǔn)提供參考。