茶多糖含量的快速測(cè)定方法

張子玉，汪東風(fēng)，范明昊，吳 姝，裴登邑，汪曙暉

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.青島市疾病預(yù)防控制中心，山東青島 266005）

茶含有多種生物活性物質(zhì)，如茶多酚、茶多糖（Tea Polysaccharides，TPS）、茶色素、茶氨酸、維生素和礦物質(zhì)等[1]。TPS是從茶葉中提取出來(lái)的與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的一種雜多糖復(fù)合物，具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗輻射、降血壓、抗血凝和抗血栓等功效[2-4]，尤其以降血糖作用突出[5]，極具應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域[6]。因此，定量分析TPS成為控制其質(zhì)量和將其開(kāi)發(fā)為功能食品的關(guān)鍵步驟之一[7]。

目前，測(cè)定多糖含量的方法主要有分光比色法[8]、高效液相色譜法[9]、酶法[10]等。采用高效液相色譜法與酶法測(cè)定時(shí)樣品前處理工序比較煩瑣，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，且檢測(cè)費(fèi)用較高，不便快速測(cè)定。傳統(tǒng)的分光比色法通常以葡萄糖或其他單糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如《枸杞多糖》（QB/T 5176—2017）中以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[11]。但由于TPS是一種有蛋白質(zhì)結(jié)合的雜多糖復(fù)合物，采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與真實(shí)值偏差較大[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，用綠茶及烏龍茶的TPS作為苯酚-硫酸反應(yīng)的多糖標(biāo)準(zhǔn)品，與葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品的苯酚-硫酸法，通過(guò)校正系數(shù)2.038，可建立一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的測(cè)定綠茶和烏龍茶中TPS含量的理想方法[12]。傅博強(qiáng)等[13]對(duì)江西婺源不同茶場(chǎng)茶葉中多糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，用精制TPS測(cè)得TPS對(duì)葡萄糖的校正系數(shù)，不同茶葉品種的校正系數(shù)均不相同，婺源紅碎茶為3.961、婺源綠茶為4.268、福建安溪烏龍為4.272。張星海等[14]建立一種茶樹(shù)花多糖含量的校正系數(shù)蒽酮-硫酸檢測(cè)方法，結(jié)果以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品時(shí)校正系數(shù)f半乳糖=2.84，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品時(shí)校正系數(shù)f葡萄糖=4.49。上述校正系數(shù)的不同，可能與不同的茶葉種類(lèi)的工藝對(duì)其單糖、雙糖、低聚糖等含量有影響，從而影響其TPS對(duì)葡萄糖的校正系數(shù)[15]。

測(cè)定茶葉TPS時(shí)，提取方法不盡相同，陳建國(guó)等[16]采用直接水提法進(jìn)行測(cè)定，也有研究者們采用50%～80%乙醇水溶液除去游離糖后進(jìn)行水提測(cè)定[17-20]，《竹葉中多糖的檢測(cè)方法》（GB/T 40632— 2021）[21]采用水提后95%醇沉法進(jìn)行樣品多糖測(cè)定，此外參考《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》（SN/T 4260—2015）檢測(cè)方法[22]，考慮到方法快速準(zhǔn)確性，通過(guò)比較水提法和80%乙醇清洗水提法的差異，對(duì)茶葉中TPS的測(cè)定進(jìn)行優(yōu)化，為合理開(kāi)發(fā)、利用茶葉中TPS資源提供幫助，同時(shí)使測(cè)定茶葉樣品中TPS含量的方法更準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 儀器

BSA124S電子天平[賽多維斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、SHA-C恒溫振蕩器（常州國(guó)華儀器有限公司）、GL-20B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、1260系統(tǒng)高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、多功能酶標(biāo)儀SpectraMax iD3[美谷分子儀器（上海）有限公司]、手提式高速粉碎機(jī)DFT-50A（上海左樂(lè)儀器有限公司）、250 mL容量瓶、10 mL具塞試管等。

1.1.2 試劑與材料

市場(chǎng)收購(gòu)曬青綠茶加TPS及未加TPS的茶餅，云南綠鑫茶業(yè)公司產(chǎn)曬青綠茶加TPS及未加TPS茶餅、白茶加TPS及未加TPS茶餅，云南彤瑞茶葉公司產(chǎn)于2017年的普洱熟茶餅及2022年的普洱熟茶餅，上述茶樣分別編號(hào)為1～8；夏季云南大葉種茶樹(shù)粗老葉，曬干備用；D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品[Merck（德國(guó)）]、苯酚、濃硫酸和乙醇均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 TPS的提取及純化

以夏季云南大葉種茶樹(shù)粗老葉為原料，參考FAN的方法[23]，使用蒸餾水在80 ℃下提取夏季云南大葉種茶樹(shù)粗老葉的TPS 1.5 h，并重復(fù)兩次。離心去除污染物。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮上清液。添加80%的乙醇水溶液，通過(guò)過(guò)濾分離沉淀，再溶解在水中，重復(fù)沉淀和再溶解兩次。用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚交替洗滌純化的沉淀以除去小分子，并重復(fù)兩次。將沉淀溶解在水中，并用適量交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮處理以去除蛋白質(zhì)和多酚，離心。冷凍干燥上清液，得到粗TPS粉末，將TPS粉末配制成濃度為2.00 mg·mL-1的溶液，以1.50 BV·h-1的速度上樣于預(yù)先處理填充好的D315樹(shù)脂層析柱。用蒸餾水洗脫，將流出液與蒸餾水洗脫液合并，50 ℃旋蒸濃縮，透析3 d，每6 h更換一次蒸餾水，冷凍干燥得到純化的TPS。

1.2.2 TPS檢測(cè)色譜條件

在配有RID型折射率檢測(cè)器和TSK G3000PW柱（7.8 mm×30.0 cm）的1260系統(tǒng)高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）上測(cè)試粗TPS及純化的TPS的純度。檢測(cè)器及柱子溫度設(shè)置為30 ℃，IR的測(cè)量范圍設(shè)置為32 AUFS，0.5 mL min-1水中洗脫。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取105 ℃干燥恒重的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和純化的TPS 0.01 g，采用苯酚-硫酸法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[7]。

1.2.4 樣品溶液的制備及測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17-20]用80%乙醇溶液洗茶，再水提的方法提取TPS待測(cè)樣，具體方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g（精確到0.000 1 g）勻質(zhì)樣品粉末于250 mL錐形瓶中，加入20 mL體積濃度80%的乙醇水溶液，振蕩混勻，置超聲波提取器中超聲提取30 min，再以 3 000～4 000 r·min-1離心10～20 min，移除上清液；以離心所得的殘?jiān)娲鲜龃郎y(cè)樣品，重復(fù)2～3次，以除去可溶性單糖及低聚糖部分，殘?jiān)脽崴粗猎F形瓶中，加沸蒸餾水100 mL，立即移入沸水浴中，磁力攪拌浸提45 min，浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭繜嵴麴s水洗滌2～3次，將濾液移入 250 mL容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法測(cè)定。

參考文獻(xiàn)[16]中采用直接水提法制備TPS待測(cè)樣，具體方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g（精確到0.000 1 g） 勻質(zhì)樣品粉末于250 mL錐形瓶中，加沸蒸餾水 100 mL，立即移入沸水浴中，磁力攪拌浸提 45 min，浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭繜嵴麴s水洗滌2～3次，將濾液移入250 mL容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法測(cè)定。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定方法測(cè)定吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中多糖的含量。樣品中TPS含量為

式中：w為樣品中TPS含量，%；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得樣品測(cè)定液中的TPS含量，μg；v1為樣品定容體積，mL；m2為樣品質(zhì)量，μg；v2為比色測(cè)定時(shí)移取樣品測(cè)定液的體積，mL。

1.2.5 校正系數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取純化的TPS 0.01 g，用水定容至100 mL。采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定其吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出此純化的TPS貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算校正系數(shù)（f）為

式中：m為稱(chēng)取純化的TPS的質(zhì)量，mg；C為純化的TPS貯備液中葡萄糖質(zhì)量濃度，mg·mL-1；D為T(mén)PS溶液稀釋因子。

1.2.6 加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

精密稱(chēng)取已知濃度的勻質(zhì)樣品粉末0.4 g（精確到0.000 1 g），分別放入250 mL錐形瓶中，精密加入純化的TPS對(duì)照品40.0 mg，按1.2.2、1.2.3方法制備樣品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）。在結(jié)束反應(yīng)冷卻后不同的時(shí)間間隔（0 h、0.5 h、1.0 h）對(duì)TPS含量進(jìn)行分析，以檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。取6份1號(hào)樣本用1.2.4樣品溶液制備中80%乙醇清洗水提法分別單獨(dú)制備，以測(cè)試其重復(fù)性。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用OriginPro 2019b繪制色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗TPS及純化TPS的色譜圖

由圖1可知，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)純化TPS為明顯一單峰，表明該TPS純度高。

圖1 粗TPS及純化TPS在HPLC上的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及樣品中多糖含量

以490 nm處的吸光度為y軸，以TPS的含量為x軸，構(gòu)建一條回歸線(xiàn)。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.009 4x+0.089 6，R2=0.997 8，TPS標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(xiàn)y=0.005x+0.079 5，R2=0.997 0(圖2)。從圖2可看出選擇葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)會(huì)導(dǎo)致TPS含量較實(shí)際值偏小，使測(cè)得樣品的TPS含量偏低，使用TPS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)則可以避免。

圖2 苯酚-硫酸法建立葡萄糖與TPS在490 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

采用葡萄糖與純化的TPS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行樣品中TPS含量的計(jì)算，樣品直接用水提法測(cè)TPS含量結(jié)果如表1，經(jīng)過(guò)80%乙醇水溶液洗后水提法測(cè)多糖含量結(jié)果如表2。結(jié)果表明，以純化的TPS作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可降低葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的偏差，這與WANG[12]的研究結(jié)果一致。此外，通過(guò)80%乙醇水溶液洗后水提法測(cè)得的TPS含量與水提法測(cè)得的TPS含量差異明顯，這說(shuō)明先用80%乙醇超聲提取可除去單糖、雙糖、低聚糖、甙類(lèi)、生物堿、茶多酚、氨基酸及醇溶性蛋白等干擾性成分，再用水提取其中所含的TPS，使TPS含量測(cè)定不受干擾性成分的影響，這與GIANNOCCARO[17]的研究結(jié)果 一致。

表1 樣品水提TPS含量

表2 樣品醇洗水提TPS含量

2.3 校正系數(shù)

因TPS是一種復(fù)合物，糖部分僅是其組成成分之一[24]，以純化的TPS作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由1.2.5校正系數(shù)公式求得校正系數(shù)為1.95，以避免葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的檢測(cè)值偏低。通過(guò)葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品醇洗水提TPS含量結(jié)果為4.45%、4.04%、2.82%、2.01%、3.43%、3.07%、3.68%和3.49%，再乘校正系數(shù)1.95以校正結(jié)果，為8.68%、7.88%、5.50%、3.92%、6.69%、5.99%、7.18%和6.80%，可看出結(jié)果與直接使用純化的TPS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的結(jié)果極為接近，說(shuō)明使用校正系數(shù)可對(duì)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出的含量進(jìn)行較好地校正。這比傅博強(qiáng)等[13]采用不同茶葉品種、不同產(chǎn)地進(jìn)行TPS檢測(cè)方法得到的校正系數(shù)紅碎茶3.961，綠茶4.220較低。WANG[12]提取綠茶及烏龍茶的TPS，同時(shí)用苯酚-硫酸法建立葡萄糖與TPS在490 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到校正系數(shù)2.038，因綠茶及烏龍茶與原料本身更為接近，因此得出的校正系數(shù)較為可靠。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)茶葉未加工原料修剪枝葉提取TPS，結(jié)果得到校正系數(shù)與周小玲[7]極為接近，可避免不同的茶葉種類(lèi)及工藝對(duì)其單糖、雙糖、低聚糖等含量的 影響。

2.4 加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

水提法及80%乙醇洗水提法加純化的TPS對(duì)照品的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、表4，水提法平均回收率為98.74%，RSD為1.81%，80%乙醇洗水提法平均回收率為98.26%，RSD為3.05%，說(shuō)明平均回收率不受TPS提取方法的影響，且該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 樣品水提TPS回收率

表4 樣品醇洗水提TPS回收率

方法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，待測(cè)液在結(jié)束反應(yīng)冷卻后0 h、0.5 h、1.0 h再次測(cè)定其吸光度，并計(jì)算TPS含量，以確定方法的穩(wěn)定性，從表5可看出，反應(yīng)結(jié)束顯色基本穩(wěn)定，RSD值為1.36%。取6份1號(hào)樣本用1.2.4樣品溶液制備中80%乙醇清洗水提法分別單獨(dú)制備，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性，RSD值為3.01%，如表6。

表5 方法穩(wěn)定性

表6 方法重復(fù)性

3 結(jié)論

為快速檢測(cè)TPS含量，本文對(duì)茶葉中TPS水提法和80%乙醇水洗后水提法的差異進(jìn)行了比較，并同時(shí)用D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和純化的TPS作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定茶葉中TPS含量。先用兩種提取方法進(jìn)行TPS提取，再利用D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和純化的TPS作為標(biāo)準(zhǔn)品分別得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TPS含量，確定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)純化的TPS標(biāo)準(zhǔn)品的校正系數(shù)為1.95，檢測(cè)方法學(xué)考察表明該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性好（RSD=1.36%），重復(fù)性強(qiáng)（RSD=3.01%），加標(biāo)回收率較高（平均回收率=98.26%±3.00%），方法準(zhǔn)確度較高。用校正系數(shù)計(jì)算樣品中TPS含量，結(jié)果分別為8.68%、7.88%、5.50%、3.92%、6.69%、5.99%、7.18%和6.80%，使結(jié)果更接近于使用純化TPS的測(cè)定值。

因此，使用茶樹(shù)粗老葉提取純化的TPS作標(biāo)準(zhǔn)品，80%乙醇水洗后水提法制備測(cè)試液，用苯酚-硫酸法快速測(cè)定，可作為不同茶葉樣品TPS含量的簡(jiǎn)便測(cè)定方法。