黑米稻育種及果皮色素遺傳研究進展

張家健，汪雨萍，劉海平，蔣 龍，歐陽真誠，何 勝，劉 楊，張 璞，謝建萍，羅 杰，章 萍，李德悅，張紅林*

（1.贛州市農(nóng)業(yè)科學研究所，江西 贛州 341000；2.贛州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西 贛州 341000）

黑米稻是水稻的變種，具有種植歷史悠久、分布范圍廣、品種資源豐富、遺傳多樣性等特點。黑米稻谷經(jīng)礱谷脫殼而成的糙米被稱為黑米，其果皮呈黑色、紫黑色或黑褐色。研究發(fā)現(xiàn)，黑米含有豐富的蛋白質(zhì)、花青素、植物脂肪、維生素、礦質(zhì)元素、黃酮類化合物等營養(yǎng)成分，具有重要的食用、藥用價值及特殊的工業(yè)用途，被廣泛應用于食品、醫(yī)療保健品、工業(yè)天然染料等行業(yè)領域［1-4］。黑米用途廣泛、需求量大，且我國黑米年產(chǎn)量巨大。據(jù)美國農(nóng)業(yè)局統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2017年中國黑米總產(chǎn)量為148.87萬t，占世界黑米總產(chǎn)量的35.5%左右［5］。近年來，為促進黑米相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展，推動黑米消費市場升級，科研工作者們進行了大量黑米稻優(yōu)質(zhì)品種選育和優(yōu)質(zhì)性狀遺傳機理方面的研究。

1 黑米稻種質(zhì)資源情況

中國擁有豐富的黑米稻種質(zhì)資源，賴來展等［6］研究表明：在統(tǒng)計到的411個世界黑米資源中，中國擁有373個不同的黑米品種類別，占比90.8%。這些品種按粒型分為秈型、粳型2種，以秈型黑米稻為主；按粒質(zhì)分為糯性和粘性2種類型，以黑糯稻品種資源占比較多。代表品種資源有洋縣黑谷、容縣黑糯、香血糯、海南黑米、黑香粳糯等。目前，仍有一些優(yōu)質(zhì)地方黑米稻品種在我國部分水稻生產(chǎn)區(qū)保留種植。自身遺傳物質(zhì)的不同和長期環(huán)境的差異造成了黑米稻品種資源的千差萬別，在這些黑米稻種質(zhì)資源中，有富含蛋白質(zhì)的黑米稻種質(zhì)資源，也有富含礦物質(zhì)的黑米稻種質(zhì)資源，還有富含花青素的黑米稻種質(zhì)資源等。

2 黑米稻品種選育情況

近年來，水稻育種科技工作者們以地方黑米稻種質(zhì)材料或其他稻種資源為基礎材料，通過育種技術方法成功培育了一批黑米稻新品種，部分優(yōu)質(zhì)黑米稻品種已通過審定。近年審定的黑米稻品種以常規(guī)、秈型、糯性品種為主，雜交黑米稻品種較少，這與我國傳統(tǒng)黑米稻種質(zhì)資源類型情況及黑米需求市場緊密相關。我國傳統(tǒng)黑米稻品種生育期一般為140～170 d，株高150 cm，產(chǎn)量在1500～5000 kg/hm2之間，或略高［7］。2010年之前，黑米稻審定品種的生育期集中于140～170 d之間，與傳統(tǒng)黑米稻品種接近；2011年以后，通過審定的黑米稻品種生育期一般在105～140 d。在株高和產(chǎn)量方面，1983～2021年審定的黑米稻品種株高集中于90～120 cm；產(chǎn)量一般在5000 kg/hm2以上，部分產(chǎn)量達8000～10000 kg/hm2。此外，近年選育的黑米稻品種在抗性上較傳統(tǒng)黑米稻品種有明顯增強。生育期的縮短、產(chǎn)量的提高及抗性的增強，使近年選育的黑米稻品種更加適應市場需求。

3 黑米稻果皮顏色的遺傳研究

黑米稻果皮顏色與普通稻有著直觀而明顯的區(qū)別，黑米稻果皮是由母本子房壁發(fā)育而成的，因此，黑米稻果皮顏色性狀主要受母本基因型控制。近年來，對黑米稻性狀遺傳的研究主要集中在黑米稻果皮顏色性狀遺傳探究方面。

3.1 黑米稻果皮色素基因研究

目前已發(fā)現(xiàn)與黑米稻果皮色素相關的基因主要有Ra基因、Pb基因、Pp基因、Kala4基因、Kala3基因等。

3.1.1Ra基因Ra基因最早由Hu等［8-9］研究發(fā)現(xiàn)，并定位于水稻第4染色體上，由Ra1基因和Ra2基因組成，編碼bHLU（基本螺旋-環(huán)-螺旋）轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控水稻花青素的生物合成途徑。通過基因測序發(fā)現(xiàn)，不同黑米稻品種Ra基因序列基本相同，與白米稻品種相比，均在起始密碼子后第7外顯子處存在2 bp的GT缺失［10-12］。梁婷婷［13］對黑米Ra基因的功能進行了驗證分析，發(fā)現(xiàn)Ra基因主要通過bHLH蛋白復合物影響花青素成基因ANS的表達量來促進黑米果皮中花青素物質(zhì)的累積。

3.1.2Pb基因Pb基因（Prp-b）位于第4號染色體上，由Hsieh等［14］于1964年發(fā)現(xiàn)，其控制紫黑米果皮顏色性狀表達。王彩霞等［15］以豫南黑秈糯、川黑糯與培矮64S雜交，通過F2代分離群體對Pb基因進行精細定位，將Pb基因定位于一段25 kb范圍的標記之間，并根據(jù)前人研究結(jié)果和基因性質(zhì)推測Pb基因與Ra基因為同一基因，該基因第7外顯子內(nèi)GT的缺失與黑米果皮顏色性狀緊密相關。Rahman等［16］發(fā)現(xiàn)黑米果皮的顯性Pb基因相對于白米果皮的隱性Pb基因存在2 bp（GT）的缺失，并且水稻果皮色澤的形成至少需要1個顯性Pb等位基因的存在。

3.1.3Pp基因Pp基因（Prp-a）位于第1號染色體上，也是由Hsieh等［14］于1964年發(fā)現(xiàn)的，與Pp基因共同作用使水稻果皮呈現(xiàn)紫黑色，只有Pp基因作用時果皮表現(xiàn)為白色。Rahman等［16］選用黑米品種“Heugnambyeo”與3個白色果皮水稻品種雜交，通過分析后代不同基因型的表型認為，水稻紫黑色果皮性狀是受2對互補等位顯性基因Pp和Pb控制的，Pp等位基因?qū)﹄[性Pp等位基因表現(xiàn)為不完全顯性，Pp顯性等位基因的數(shù)量決定了黑米中花青素-3-葡萄糖苷的濃度和果皮顏色的深淺。王曉光［17］以紫香糯和春江糯2號為親本，通過構(gòu)建黑米果皮顏色近等基因系，經(jīng)分析F2代分離群體比，認為黑米果皮顏色性狀符合Hsieh等［14］由2對基因Pp和Pb控制的觀點。

3.1.4Kala4基因 Oikawa［18］等通過構(gòu)建黑米和白米的分離群體發(fā)現(xiàn)了Kala4基因，并將Kala4基因定位于水稻第4號染色體Os04g0557500基因的一段25.6 kb的基因組區(qū)域內(nèi)。通過FPNI-PCR和DNA凝膠印跡分析發(fā)現(xiàn)，黑米果皮顏色性狀起源于Kala4基因重復序列異構(gòu)引起的bHLH基因異位表達。朱思然［19］研究發(fā)現(xiàn)，黑米和白米中Kala4基因啟動子區(qū)域的結(jié)構(gòu)存在不同，通過分析認為，稻米果皮顏色的性狀受Kala4基因的調(diào)控，并且Kala4基因?qū)诿坠ば誀畹男纬善鹬鴦┝啃淖饔谩?/p>

3.1.5Kala3和OsMYB3基因Kala3和OsMYB3基因均為R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。Kim等［20］研究發(fā)現(xiàn)，黑色果皮水稻品種的Kala3啟動子區(qū)比紅色和白色品種多一個串聯(lián)的重復多態(tài)序列，分析認為Kala3啟動子內(nèi)的重復次數(shù)與Kala3的轉(zhuǎn)錄激活相關，并且Kala3與Kala4基因共同介導了水稻花青素生物合成基因的激活。趙明超［21］通過對45份黑米和533份水稻糙米的花青素含量進行全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)水稻第3號染色體上的OsMYB3和第4號染色體上的Kala4與糙米花青素累積顯著關聯(lián)，OsMYB3、Kala4和OsPAC1可以兩兩互作并結(jié)合形成三元復合體，激活花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達。

3.2 黑米稻果皮顏色的遺傳分析

黑米稻果皮顏色的深淺與果皮中花青素的含量緊密關聯(lián)，黑米所含花青素越高，則果皮顏色越深［19］。而黑米稻果皮花青素含量的多少跟花青素的合成、累積、降解有關，主要受相關基因控制。綜合已發(fā)現(xiàn)的黑米果皮色素基因分析，黑米果皮顏色性狀與多基因表達相關，呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳，存在顯性、加性和隱性上位性效應。這些基因包括Ra/Pb、Kala4、Pp、Kala3、OsMYB3基因等，但在不同黑米品種中控制黑米果皮顏色性狀的主要基因有所差異?！疤鸷诿住?、豫南黑秈糯、川黑糯等材料中果皮呈現(xiàn)黑色，主要是受1對顯性等位基因Ra/Pb控制；Heugnambyeo、紫香糯等材料果皮顏色性狀主要受2對等位基因Ra/Pb和Pp基因的共同作用，其中Ra/Pb顯性等位基因參與控制水稻的果皮色澤，Pp顯性等位基因的數(shù)量決定黑米中花青素-3-o-葡萄糖苷的濃度，進而影響黑米果皮顏色的深淺；黑米稻Koshihikari品種果皮顏色同時受到bHLH轉(zhuǎn)錄因子Kala4基因、R2R3-Myb轉(zhuǎn)錄因子Kala3基因和Kala1基因的共同調(diào)控。

4 黑米稻育種方法

4.1 黑米稻系統(tǒng)育種

育種工作者從現(xiàn)有的或傳統(tǒng)的黑米稻品種中選擇變異單株，經(jīng)鑒定、品種比較，獲得目標黑米新品種。近年來，通過系統(tǒng)法選育的黑米稻品種有贛南黑米、錦黑稻1號、雙亞黑一號、海豐黑糯2號、銀黑香粳等。

4.2 黑米稻雜交育種

利用水稻雜種優(yōu)勢理論，對現(xiàn)有的水稻種質(zhì)資源或傳統(tǒng)黑米稻品種等進行雜交改良，選育黑米稻不育系、恢復系、保持系和優(yōu)質(zhì)黑米稻新品種，實行黑米雜交稻的兩系配套生產(chǎn)和三系配套生產(chǎn)。通過雜交育種方法培育的黑米稻品種有純黑一號、紫兩優(yōu)737、珍粳168、“黑珍珠”等。

4.3 黑米稻誘變育種

利用物理、化學誘變獲得的突變植株材料是培育水稻新種質(zhì)材料的一種有效方法。早在1993年洋縣黑米名特作物研究所利用太空輻射誘變方法對“洋縣黑稻”種質(zhì)資源進行了改良，于21世紀初育成了洋黑糯4號［22］。Nao等［23］為改良日本福島傳統(tǒng)黑色糯米品種yayi-murasaki的落粒性，利用γ射線進行誘變處理，從落粒性、育性、穗型方面篩選出了幾個株系，用于yayoi-murasaki優(yōu)質(zhì)新品種的選育。Purwanto等［24］用100 Gyγ射線誘導處理了黑米稻品種Boyalati和Bantul的突變株，并對黑米M4代材料進行了干旱處理，篩選出抗旱高產(chǎn)的黑米稻新品種。黃藝寧等［25］利用60Co-γ射線對揚稻6號干種子進行了輻射誘變，并對果皮黑色突變體進行自交選育，獲得了繼承原始親本揚稻6號大部分農(nóng)藝性狀的黑米稻R9311-01。周姚［26］利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）誘變黑米品種黑帥發(fā)生了突變，獲得了67株與花青素積累相關的突變株。

4.4 黑米稻分子標記輔助育種

分子標記輔助育種技術在黑米育種上的應用主要是對控制黑米果皮基因或連鎖基因進行分子標記，通過檢測相關標記基因，快速篩選出黑米材料。蔡治君等［27］利用分子標記技術對香型巨胚水稻中間材料“2009-211H”和非香正常胚黑色糯性水稻“上實黑糯”的雜交后代進行香味基因和蠟質(zhì)基因篩選，選育出產(chǎn)量顯著高于父本“上實黑糯”的黑色香型巨胚水稻新株系。曾躍輝［12］利用特異性分子標記對黑米水稻品種的果皮基因進行基因型鑒定和黑米雜交品種的選育。張桂權(quán)［28］利用分子標記輔助選擇的方法結(jié)合雜交、回交等傳統(tǒng)育種方法，以華粳74為受體，黑米品種聯(lián)鑒33為供體選育獲得了華小黑1號黑米品種。

4.5 基因工程技術創(chuàng)制黑米稻育種材料

黃昕穎［29］利用農(nóng)桿菌介導法，將葡萄花青素還原酶（ANR）基因?qū)氲健昂诰取焙汀跋阊础敝蝎@得了比原花青素含量更高的轉(zhuǎn)基因黑米植株。Susanto等［30］對Hd3a開花基因進行了RPP16啟動子編輯，并通過農(nóng)桿菌介導法導入到印尼黑米植株中，獲得開花早表型的轉(zhuǎn)基因植株，縮短了全生育期。周姚［26］以黑米品種黑帥的基因為模板擴增了花青素代謝途徑中的7個重要結(jié)構(gòu)基因，利用轉(zhuǎn)基因育種技術將結(jié)構(gòu)基因?qū)氲桨酌灼贩N中，獲得了相關結(jié)構(gòu)基因超表達植株。梁婷婷［13］為確定Ra基因在植物中的功能，以甜黑米為材料，通過農(nóng)桿菌介導法將Ra基因?qū)氲饺毡厩缰?，獲得了轉(zhuǎn)基因植株材料。陳美春［31］采用基因工程技術將ANR基因?qū)氲胶诿?31成熟胚的愈傷組織中，獲得了攜帶ANR基因的抗性愈傷組織。

5 展望

中國黑米稻種質(zhì)資源具有分布范圍廣、資源豐富、適應性強、生態(tài)多樣等優(yōu)點，但傳統(tǒng)的黑米資源一般表現(xiàn)為株葉形態(tài)差、產(chǎn)量低、易倒伏、抗病性差等特點［7］?，F(xiàn)實中種植戶種植傳統(tǒng)黑米稻的效益一般，大量傳統(tǒng)地方黑米稻種質(zhì)資源在生產(chǎn)中慢慢遺失。因此，加強地方優(yōu)質(zhì)黑米稻種質(zhì)資源的保護，建立黑米稻種質(zhì)資源庫是非常有必要的。

黑米含有比普通大米更加豐富的蛋白質(zhì)、多種維生素、胡蘿卜素和粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，以及Fe、Ca、Zn、Se等多種微量元素和特殊生理活性成分（多酚、黃酮類等）［30］，具有重要的抗氧化、抗衰老、降血脂、預防心血管疾病、預防癌癥等重要功效［32-38］，但黑米稻較普通水稻而言產(chǎn)量更低，食用適口性更差。因此，以市場需求為導向，利用現(xiàn)代育種技術提高黑米稻產(chǎn)量和功能營養(yǎng)物質(zhì)含量，改善黑米適口性是黑米稻育種的重要方向。

黑米稻果皮顏色性狀與多基因表達相關，呈現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳，存在顯性、加性和隱性上位性效應，但不同品種果皮顏色所受的主要控制基因有所差異。已定位出影響黑米稻果皮色素的基因主要有Ra/Pb、Pp、Kala4、OsMYB3基因，其中Pp基因位于第1號染色體，OsMYB3基因位于第3號染色體，Ra/Pb、Kala4基因在第4號染色體。此外，在第6、10、11、12號染色體上也發(fā)現(xiàn)存在影響黑米稻果皮顏色的相關基因。因此，對黑米稻果皮顏色的遺傳機理和控制基因還需進一步深入研究。