蝦肝腸胞蟲的檢測與控制技術(shù)研究進(jìn)展

曹海鵬，夏婷婷，許 拉，蓋春蕾

( 1.上海海洋大學(xué) 國家水生動(dòng)物病原庫，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 2. 山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104 )

蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei)，又名“腸道上皮細(xì)胞孢子蟲”，于2003年被Chayaburakul等[1]首次發(fā)現(xiàn)，2009年由Tourtip等[2]從生長緩慢的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)中分離并命名，主要感染斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)等主要養(yǎng)殖蝦類，除了長期肆虐印度、韓國、泰國等[3-5]多個(gè)國家的對蝦養(yǎng)殖外，對我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)和食品安全也造成了威脅。2013年，我國養(yǎng)殖凡納濱對蝦首次檢出蝦肝腸胞蟲，隨后在江蘇、山東、遼寧等地[6-9]的養(yǎng)殖對蝦中也出現(xiàn)了不同程度的蝦肝腸胞蟲感染。因此，為降低蝦肝腸胞蟲對對蝦養(yǎng)殖和食品安全的危害，建立高效實(shí)用的蝦肝腸胞蟲的檢測與控制技術(shù)具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，蝦肝腸胞蟲的檢測與控制技術(shù)研究取得了較大的進(jìn)展，如建立了蝦肝腸胞蟲的組織學(xué)檢測技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)，探索了蝦肝腸胞蟲的控制技術(shù)。鑒此，筆者在簡述蝦肝腸胞蟲的生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上，概述了蝦肝腸胞蟲的國內(nèi)外最新檢測與控制技術(shù)研究現(xiàn)狀，并根據(jù)蝦肝腸胞蟲現(xiàn)有檢測與控制技術(shù)研究的不足對未來的研究方向進(jìn)行展望，旨在為蝦肝腸胞蟲的檢測與控制提供參考。

1 蝦肝腸胞蟲的生物學(xué)特征

蝦肝腸胞蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲，具有危害養(yǎng)殖生產(chǎn)的4個(gè)生物學(xué)特征：(1)生活史簡單。蝦肝腸胞蟲的生活史分為孢子期、增殖期和孢子繁殖期3個(gè)階段[9]，不需要中間宿主[10]，且周期短，整個(gè)過程僅為5～11 d。(2)感染機(jī)制復(fù)雜。蝦肝腸胞蟲對宿主細(xì)胞的感染過程包括孢子激活、發(fā)芽、孢原質(zhì)侵入宿主細(xì)胞，在感染宿主細(xì)胞過程中會(huì)發(fā)生孢子壁彎曲與突起、極管的解螺旋與彈出、孢原質(zhì)注入宿主細(xì)胞等現(xiàn)象[2,11-16]，也存在多種與黏附、侵染、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和免疫反應(yīng)等相關(guān)的蛋白，如孢壁蛋白SWP7、多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶12、鈣黏蛋白等[17]。(3)傳播途徑多樣。蝦肝腸胞蟲的傳播途徑包括垂直傳播和水平傳播。相關(guān)研究證實(shí)[10,18-20]，感染蝦肝腸胞蟲的親蝦孵出的無節(jié)幼體、溞狀Ⅰ期和Ⅱ期幼體中均能檢出蝦肝腸胞蟲；健康蝦攝食攜帶蝦肝腸胞蟲的病蝦，或與病蝦同居，或生活在含蝦肝腸胞蟲的養(yǎng)殖環(huán)境中均能被蝦肝腸胞蟲感染。(4)早期感染臨床癥狀不明顯[21]。蝦肝腸胞蟲通過肝胰臟的小管上皮細(xì)胞對宿主進(jìn)行慢性感染，抑制機(jī)體內(nèi)鐵蛋白和小分子GTP酶Rab11A等免疫因子，使機(jī)體生長緩慢[22-23]，免疫力降低[17]，繼發(fā)弧菌感染[24]。只有在機(jī)體生長發(fā)育后期才會(huì)出現(xiàn)殼軟、中腸空、肝胰腺變色并有中度壞死的小管從基底膜脫離等明顯癥狀[25]。

2 蝦肝腸胞蟲的檢測技術(shù)研究現(xiàn)狀

2.1 組織學(xué)檢測技術(shù)

組織學(xué)檢測是通過對組織進(jìn)行石蠟切片、染色，然后在顯微鏡下觀察病原的方法[26]，具有直觀、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在組織顏色干擾，檢出率不高等缺陷[27]。目前，為了克服組織學(xué)檢測方法的缺陷，相關(guān)研究創(chuàng)新了組織中蝦肝腸胞蟲染色方法。常曉晴等[28]比較了蘇木精—伊紅染色法、甲苯胺藍(lán)染色法、愛顯藍(lán)—雪夫染色法、馬松染色法、偉郝夫范吉森染色法、普魯士藍(lán)染色法、勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色法和天狼猩紅染色法等8種染色方法對組織內(nèi)蝦肝腸胞蟲的染色效果，發(fā)現(xiàn)馬松染色法十分適用于組織內(nèi)的蝦肝腸胞蟲染色。Zhao等[29]采用熒光染色法將鈣熒光白作為染色劑檢測組織樣品中蝦肝腸胞蟲的孢子，證實(shí)鈣熒光白不會(huì)污染宿主組織，能夠顯示明顯的藍(lán)白色熒光，結(jié)果清晰，便于觀察，可作為一種無創(chuàng)、非致死的蝦肝腸胞蟲孢子觀察方法。

2.2 巢式PCR檢測技術(shù)

巢式PCR通過兩套引物，進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，其中以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，最終擴(kuò)增出完整的目的DNA片段，具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[30]，但二次擴(kuò)增會(huì)使交叉污染的幾率增大，造成假陽性結(jié)果[27]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對蝦肝腸胞蟲巢式PCR檢測技術(shù)已開展了相關(guān)研究。Tangprasittipap等[31]根據(jù)蝦肝腸胞蟲核糖體小亞基基因(SSU rRNA)序列設(shè)計(jì)引物建立了蝦肝腸胞蟲的巢式SSU-PCR檢測技術(shù)，能夠檢測到106拷貝/μL以上的模板。Jaroenlak等[32]根據(jù)蝦肝腸胞蟲孢壁蛋白質(zhì)SWP序列設(shè)計(jì)建立了蝦肝腸胞蟲的巢式SWP-PCR檢測技術(shù)，最低能夠檢測的質(zhì)粒模板為104拷貝/μL，與SSU-PCR方法相比，新的SWP-PCR檢測方法與密切相關(guān)的微孢子蟲的DNA不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性更高。葉鍵等[33]采用18S-PCR、SSU-PCR和SWP-PCR 3種方法對凡納濱對蝦、鹵蟲和水樣中蝦肝腸胞蟲進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，雖然在第一輪擴(kuò)增中18S-PCR的靈敏度高于另外兩種巢式PCR，但在第二輪巢式PCR擴(kuò)增中，SWP-PCR檢測技術(shù)的靈敏性更高，特異性更好，更適用于生物餌料、環(huán)境樣本中蝦肝腸胞蟲的檢測。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光染料，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這種染料的熒光強(qiáng)度會(huì)不斷增強(qiáng)，從而可以對反應(yīng)中的DNA進(jìn)行定量[34]，具有實(shí)時(shí)、快速等優(yōu)點(diǎn)，但隨著DNA濃度的降低，其檢測準(zhǔn)確性也隨之降低[27]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)為樣品中蝦肝腸胞蟲的檢測提供了有力的工具。Liu等[35]建立了蝦肝腸胞蟲的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)，顯著提高了蝦肝腸胞蟲的檢測靈敏度，檢測限低至40拷貝/μL。宋增磊等[36]通過將基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR的蝦肝腸胞蟲檢測進(jìn)行并樣分析，發(fā)現(xiàn)國際標(biāo)準(zhǔn)推薦的5∶1并樣檢測可以擴(kuò)展到50∶1，兩者診斷特異性和診斷靈敏度相似，可為7%以上感染率的樣本提供兼顧準(zhǔn)確性和低成本的檢測，顯著提高了蝦肝腸胞蟲的檢測效率。Piamsomboon等[37]開發(fā)了一種基于β-微管蛋白基因序列的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可對蝦肝腸胞蟲進(jìn)行特異性定量，對蝦和糞便樣本中蝦肝腸胞蟲的檢測限達(dá)到了103～105拷貝/μL，對鹵蟲和污染水體中蝦肝腸胞蟲的檢測限達(dá)到了10-2～100拷貝/μL。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是Notomi等[38]在2000年建立的新型核酸擴(kuò)增法，不需要昂貴的設(shè)備，可在等溫條件下擴(kuò)增核酸，具有檢測成本低、易于在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但對引物設(shè)計(jì)要求較高，檢測過程容易出現(xiàn)氣溶膠污染[27]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對蝦肝腸胞蟲的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)研究做了大量工作。Karthikeyan等[39]建立了蝦肝腸胞蟲的實(shí)時(shí)定量環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，檢測范圍可達(dá)到10-3～10-1拷貝/μL。Sathish Kumar等[40]建立了蝦肝腸胞蟲的SYBR Green Ⅰ可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，檢測限低至10拷貝/μL，而且還設(shè)計(jì)了一種簡便、廉價(jià)的密閉管擴(kuò)增法，即用注射器和針頭向擴(kuò)增后的小瓶中加入SYBR Green Ⅰ染料，避免了氣溶膠污染。孫妍等[41]基于蝦肝腸胞蟲的核糖體小亞基基因設(shè)計(jì)6個(gè)引物，建立了新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，35～40 min內(nèi)即可完成樣品的檢測，且與對蝦常見病毒均無交叉反應(yīng)。陳進(jìn)會(huì)等[42]建立了蝦肝腸胞蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法，將檢測時(shí)間縮短到30 min內(nèi)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果符合率達(dá)到97%。Ma等[43]利用綠色熒光核酸染料SYTO-16建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測蝦肝腸胞蟲的方法，靈敏度達(dá)到了10拷貝/μL，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果的符合率達(dá)到96.9%，在不需要特殊設(shè)備的情況下，20 min內(nèi)完成分析。

3 蝦肝腸胞蟲的控制技術(shù)研究現(xiàn)狀

3.1 生態(tài)控制技術(shù)

生態(tài)控制技術(shù)是依據(jù)宿主自身防御系統(tǒng)的抗寄生蟲原理，人為調(diào)控宿主、寄生蟲和水體環(huán)境三者之間的關(guān)系，改善宿主賴以生存的水域環(huán)境，誘導(dǎo)宿主啟動(dòng)自身防御系統(tǒng)，增強(qiáng)宿主抗寄生蟲感染的能力，有效抑制寄生蟲的侵襲，是控制寄生蟲的有效手段[44]。Aldama-Cano等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蝦肝腸胞蟲的孢子在-20 ℃下處理2 h后可被100%滅活。丁慧昕等[45]進(jìn)一步用攜帶蝦肝腸胞蟲的鮮活病蝦和-20 ℃冷凍病蝦的肝胰腺組織投喂健康凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)冰凍病蝦肝胰腺投喂組的陽性檢出率為12.5%，而鮮活病蝦肝胰腺投喂組的陽性檢出率為45.8%，證實(shí)-20 ℃凍存鮮活餌料使其攜帶的蝦肝腸胞蟲喪失了侵染性。因此，將鮮活餌料在-20 ℃凍存2 h以上，減少和清除其攜帶蝦肝腸胞蟲的生物量，被認(rèn)為是減少蝦肝腸胞蟲感染的良好策略。

3.2 免疫控制技術(shù)

免疫增強(qiáng)劑是具有促進(jìn)或誘發(fā)宿主機(jī)體防御反應(yīng)，增強(qiáng)宿主機(jī)體抗病能力的一類物質(zhì)[44]。近年來，微生物制劑、植物提取物等免疫增強(qiáng)劑被證實(shí)能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫水平，有效控制蝦腸肝腸胞蟲的感染。練小軍等[46]試驗(yàn)研究表明，在飼料中添加假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)KL-3 2010和微小桿菌(Exiguobacteriumsp.) KL-C2 2014能夠增強(qiáng)攜帶蝦肝腸胞蟲的凡納濱對蝦血清中的超氧化物歧化酶、過氧化物酶等非特異性免疫酶的活性，提高蝦的生長率和存活率。Tang等[19-47]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中使用芽孢桿菌、乳酸桿菌等益生菌或應(yīng)用檸檬、姜、糖棕、黑吉豆等植物天然提取物能夠有效降低蝦肝腸胞蟲引起的白便綜合征的發(fā)生。這些研究為蝦肝腸胞蟲免疫控制技術(shù)的建立奠定了良好的科學(xué)基礎(chǔ)。

3.3 藥物控制技術(shù)

藥物控制技術(shù)是利用殺驅(qū)蟲藥物控制寄生蟲的方法[44]。目前，雖然養(yǎng)殖生產(chǎn)上仍然缺少高效殺滅蝦肝腸胞蟲的藥物，但蝦肝腸胞蟲的藥物控制技術(shù)研究仍然取得了一定的進(jìn)展。Aldama-Cano等[13]觀察了次氯酸鈣、福爾馬林、高錳酸鉀對蝦肝腸胞蟲的抑制效果，發(fā)現(xiàn)15 mg/L高錳酸鉀能夠完全抑制蝦肝腸胞蟲極管的彈出而使其喪失活性。趙若恒[48]開展了17種蝦肝腸胞蟲潛在控制藥物的效果評價(jià)，篩選出4種能降低凡納濱對蝦體內(nèi)蝦肝腸胞蟲攜帶量的藥物。這些研究為養(yǎng)殖生產(chǎn)上蝦肝腸胞蟲的藥物控制技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

4 展 望

目前，雖然國內(nèi)外關(guān)于蝦肝腸胞蟲的檢測與控制技術(shù)研究取得了顯著的進(jìn)展，但仍存在一些問題，具體體現(xiàn)在以下方面：(1)組織學(xué)檢測法對蝦肝腸胞蟲的檢出率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性不高；(2)PCR方法不適用于現(xiàn)場檢測，且會(huì)出現(xiàn)DNA交叉污染的情況，影響檢測結(jié)果；(3)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)因其環(huán)引物的非特異性配對會(huì)導(dǎo)致假陽性，影響其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。(4)生產(chǎn)實(shí)踐中蝦肝腸胞蟲的控制以預(yù)防為主，嚴(yán)重缺乏蝦肝腸胞蟲的有效藥物治療技術(shù)。鑒此，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)開發(fā)出針對蝦肝腸胞蟲的高效、靈敏、低成本且適用于現(xiàn)場使用的檢測方法，如尋找蝦肝腸胞蟲特異性抗原，發(fā)展蝦肝腸胞蟲的免疫學(xué)檢測技術(shù)；將免疫學(xué)檢測技術(shù)與染色標(biāo)記法結(jié)合，提高蝦肝腸胞蟲檢測的特異性和敏感性[49]；將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與基因芯片技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)蝦肝腸胞蟲的高通量檢測[50]；開發(fā)用于快速檢測蝦肝腸胞蟲的膠體金試劑條[51]。此外，還要借助分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、寄生蟲學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的新理論與新技術(shù)，繼續(xù)篩選和鑒定蝦肝腸胞蟲侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，闡明能與之結(jié)合的宿主細(xì)胞表面受體，在此基礎(chǔ)上加快蝦肝腸胞蟲侵染宿主細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的靶向抑制藥物和蝦肝腸胞蟲疫苗的研發(fā)，切實(shí)推進(jìn)蝦肝腸胞蟲有效控制藥物的商品化進(jìn)程。