東方蠑螈脊髓損傷模型的建立及其評(píng)價(jià)

王 迪 趙 曼 陳 杰 湯 梟 李 君

(1.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖第二人民醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是一種在醫(yī)學(xué)上至今仍然不能被治愈的疾病，脊髓損傷后會(huì)使機(jī)體自損傷節(jié)段以下的部位失去感覺和運(yùn)動(dòng)功能，給人類身心帶來極大的痛苦.因此，實(shí)現(xiàn)人類脊髓損傷的再生修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家的追求.而自然界中有一些生物的再生能力則令人嘆服，比如渦蟲[1]、斑馬魚[2]、壁虎[3]、蝌蚪[4]、蠑螈[5]等.

東方蠑螈(Cynopsorientalis)，也稱中國火龍，是兩棲動(dòng)物有尾目蠑螈科的一種.它能在四肢[6]、尾部[7]、視網(wǎng)膜[8]、頜骨[9]、心臟[10]、脊髓[11]受損后實(shí)現(xiàn)再生，正是由于它的這種獨(dú)特的再生能力而成為發(fā)育生物學(xué)、再生生物學(xué)領(lǐng)域的良好模式生物.它能實(shí)現(xiàn)脊髓的軸突和神經(jīng)元再生，重塑中樞神經(jīng)系統(tǒng)，讓機(jī)體恢復(fù)感覺和運(yùn)動(dòng)功能.東方蠑螈脊髓損傷模型的成功構(gòu)建將為SCI后軸突再生和神經(jīng)再生研究提供一種有價(jià)值的動(dòng)物模型，為我們了解東方蠑螈SCI再生的細(xì)胞和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為人類的SCI治療提供新思路.

如今，對(duì)SCI再生研究的動(dòng)物模型構(gòu)建鮮有全面的報(bào)道，很多不同的損傷模型都被用來研究脊髓再生，其中最主要的兩種模型是尾部截?cái)嗪图顾铏M斷[12].尾部截?cái)嗍菃螛O損傷，脊髓將向尖端再生，其中包含了脊髓、骨骼肌、脊索、血管和皮膚的再生；而脊髓橫斷是雙極損傷，頭端和尾端都延伸到間隙并最終重新連接，主要是啟動(dòng)神經(jīng)束的再生[13].脊髓橫斷有兩個(gè)主要位置，分別位于胸椎節(jié)段和尾部節(jié)段.在胸椎節(jié)段會(huì)導(dǎo)致后肢癱瘓，可以模擬出人類遭受車禍或者疾病造成脊髓損傷的癥狀，且可根據(jù)其行為學(xué)表現(xiàn)判斷恢復(fù)情況.早期Piatt[14]就通過橫斷分別處于胚胎、幼體和成體這三種不同年齡階段東方蠑螈的主干脊髓，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育的所有階段，脊髓在解剖學(xué)和功能上都能再生，而成體需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能再生.本文將圍繞10月齡幼體東方蠑螈進(jìn)行脊髓胸部水平橫斷的方法進(jìn)行探討，并對(duì)損傷后的動(dòng)物進(jìn)行運(yùn)動(dòng)評(píng)分，為SCI再生的研究提供重要的動(dòng)物模型.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)所用東方蠑螈均購買自湖北武漢地區(qū)，飼養(yǎng)于22 ℃±3 ℃的玻璃水族箱中，水系統(tǒng)pH值保持在7.2～7.4，并給其提供水陸兩棲的生活環(huán)境，每天換水一次，投蟲干喂養(yǎng)，提供14 h白晝和10 h黑夜的光照周期，適應(yīng)一周.挑選體重為1.5 g～2 g健康東方蠑螈，雌雄不限，隨機(jī)分成兩組，模型組20只，采用脊髓橫斷術(shù)進(jìn)行脊髓損傷模型構(gòu)建；假手術(shù)組20只，只進(jìn)行椎板移除，不橫斷脊髓.各組分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，直至實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)游泳能力.所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理與動(dòng)物關(guān)愛與使用委員會(huì)批準(zhǔn).

1.2 脊髓損傷模型建立

將東方蠑螈放在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的三卡因溶液(pH=7.2～7.4)中，麻醉10 min～15 min，見動(dòng)物不再游動(dòng)且身體觸摸無反射時(shí)將動(dòng)物取出，俯臥于解剖盤中，使它的軀干區(qū)域稍微支撐起來.在它的頭部和尾部上蓋上濕潤的海綿，用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精輕輕擦拭皮膚，用無菌的13號(hào)囊膜剪對(duì)東方蠑螈脊椎T7～T9棘突處(背側(cè)前后肢1/2位置)脊椎骨進(jìn)行脊髓橫斷，建立脊髓損傷模型，肌肉和椎骨做一個(gè)橫向深切口，露出脊髓，橫斷脊髓，如圖1.用無菌PBS沖洗傷口的血液，再用手術(shù)鑷閉合傷口，在傷口滴加適量的醫(yī)用組織膠水，并在冰上靜置10 min左右.轉(zhuǎn)移到玻璃水族箱中恢復(fù)，恢復(fù)期間使用脫氯水.手術(shù)結(jié)束后約20 min即可醒來，待動(dòng)物蘇醒后將其放在平面上爬行，以后肢完全沒有輔助力量、自然拖動(dòng)前行作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn).假手術(shù)組作為對(duì)照，即在其他操作一致的前提下對(duì)脊髓只進(jìn)行暴露，不進(jìn)行橫斷.

圖1 東方蠑螈脊髓損傷模型的建立

1.3 術(shù)后護(hù)理

將兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別放在飼養(yǎng)條件相同的兩個(gè)水族箱中，使用含有抗菌素的脫氯水飼養(yǎng)，前三天置于避光環(huán)境中恢復(fù)且不喂養(yǎng)食物，防止污染水質(zhì)造成傷口感染.從第四天開始置于正常光照中且開始喂食物.

1.4 SCI模型組和對(duì)照組影像學(xué)檢測(cè)

脊髓損傷后即刻需要在低溫環(huán)境下迅速取出受損的脊髓組織，選擇的取材位置及尺寸為東方蠑螈背部損傷位點(diǎn)的上、下各4 mm，共8 mm左右，且包含椎骨，用體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定液固定標(biāo)本24 h以上，后用脫鈣液脫鈣40天，前三次每五天換一次脫鈣液，而后每日更換，脫鈣結(jié)束后使用梯度酒精組(體積分?jǐn)?shù)分別為75%、85%、90%、95%、100%的酒精)進(jìn)行脫水，后用二甲苯透明，石蠟包埋，最后使用厚度4 μm的石蠟切片，進(jìn)行Hematoxylin-Eosin(蘇木精-伊紅)染色法染色，以正常東方蠑螈作為對(duì)照，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄.

1.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)

對(duì)模型組和假手術(shù)組的后肢運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)東方蠑螈在陸上爬行和水中游泳情況，對(duì)兩組動(dòng)物手術(shù)前與術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(2 d、4 d、7 d、14 d、21 d，用0 d表示手術(shù)后立即測(cè)試的結(jié)果)后肢的運(yùn)動(dòng)和游泳功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)估.將東方蠑螈置于1 m×1 m的正方形水平濕潤礦場(chǎng)內(nèi)，充分適應(yīng)環(huán)境后，觀察其后肢反射、尾部反射、后肢爬行協(xié)調(diào)能力、腳掌著地情況、五分鐘內(nèi)爬行距離.將東方蠑螈置于15 cm×30 cm的魚缸中，盛滿1/2的飼養(yǎng)用脫氯水，充分適應(yīng)環(huán)境后觀察其后肢輔助游泳情況，三人同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1，匯總評(píng)分結(jié)果，求其平均值作圖分析.

表1 東方蠑螈后肢運(yùn)動(dòng)情況評(píng)分表

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn).以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后動(dòng)物一般情況觀察

術(shù)后短期內(nèi)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)量明顯減少，喜陸棲，對(duì)一直在爬臺(tái)上的蠑螈要在每次換水時(shí)將其放入水中自由游動(dòng)，否則會(huì)因在空氣中時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致皮膚干涸而死.術(shù)后模型組出現(xiàn)明顯的雙后肢癱瘓，尾部無輔助力量，僅能靠前肢艱難活動(dòng)，對(duì)照組則運(yùn)動(dòng)功能正常.所有蠑螈傷口恢復(fù)期間無出血，無感染，恢復(fù)良好，與預(yù)期相符.

2.2 建模成功影像學(xué)結(jié)果

從形態(tài)學(xué)染色可以看出，正常東方蠑螈的脊髓矢狀切片中，中央管周圍的室管膜細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整(如圖2A)，脊髓損傷手術(shù)處理后即刻的組織切片可見明顯切口(如圖2B)，脊髓腔中的細(xì)胞排列遭到嚴(yán)重破壞，脊髓前后斷連，表現(xiàn)為脊髓橫斷狀態(tài)，與行為學(xué)結(jié)果一致，表明建模成功.

圖2 東方蠑螈脊髓損傷建模對(duì)比圖

2.3 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果

在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d對(duì)兩組動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)、游泳、感覺和反射功能進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，結(jié)果如表2和圖3所示.發(fā)現(xiàn)SCI模型組動(dòng)物評(píng)分整體呈上升趨勢(shì)，對(duì)照組呈不變趨勢(shì)，在0 d、2 d、4 d、7 d、14 d時(shí)模型組和對(duì)照組有極顯著差異(P<0.001)，在21 d時(shí)相比有較顯著差異(P<0.01).此結(jié)果說明了模型組動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)和感覺功能在恢復(fù)，東方蠑螈具有脊髓再生修復(fù)的能力，是研究脊髓損傷再生的良好動(dòng)物模型.

表2 兩組動(dòng)物在不同時(shí)間點(diǎn)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的比較

圖3 東方蠑螈脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分

2.4 模型組和對(duì)照組的影像學(xué)結(jié)果

根據(jù)行為學(xué)的結(jié)果，選擇脊髓損傷后4天和10天的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行脊髓組織冠狀切片染色處理，觀察受損脊髓恢復(fù)的程度.根據(jù)蘇木精-伊紅染色結(jié)果可知(圖4)，SCI處理后4天仍可看到脊髓中細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)仍處于被破壞狀態(tài)，室管膜膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞散亂，脊髓中出現(xiàn)細(xì)胞空洞，散落在脊髓腔周圍.但隨著蠑螈自主恢復(fù)的進(jìn)行，脊髓損傷后10天細(xì)胞逐漸恢復(fù)規(guī)則排列，被破壞的組織結(jié)構(gòu)也逐漸還原.室管膜細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞基本規(guī)則排列，對(duì)應(yīng)行為學(xué)評(píng)分出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，但仍存在大量的細(xì)胞空洞，并未完全恢復(fù).

圖4 脊髓損傷不同時(shí)刻的橫切HE染色結(jié)果圖

3 討論

從19世紀(jì)50年代，人們就開展了針對(duì)脊髓再生的研究，近些年來，很多具備脊髓再生能力的動(dòng)物就成了再生生物學(xué)領(lǐng)域的模式生物，而關(guān)于動(dòng)物模型的建立方法則鮮有報(bào)道.東方蠑螈具有在尾部截肢、脊髓半切、脊髓完全橫斷、脊髓擠壓損傷后再生脊髓的能力，且這種能力貫穿一生[15].Piatt曾對(duì)五個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的蠑螈進(jìn)行脊髓橫斷后175天的恢復(fù)情況觀察，發(fā)現(xiàn)均能實(shí)現(xiàn)完全再生，且年齡越小越快恢復(fù)[14].本文使用10月齡幼體東方蠑螈進(jìn)行脊髓完全橫斷實(shí)驗(yàn)，此方法的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)再生速度快，有效縮短實(shí)驗(yàn)周期；(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造價(jià)低，容易獲得；(3)實(shí)驗(yàn)有很好的可重復(fù)性和可操作性，易于在相同的條件控制.該模型有一定的局限性，東方蠑螈體型小，應(yīng)謹(jǐn)慎操作，且開口不可過大，否則容易感染致死，其次，東方蠑螈椎骨堅(jiān)硬且厚實(shí)，脊髓細(xì)且脆弱，要細(xì)心操作.

Piatt的研究發(fā)現(xiàn)在幼體蠑螈中，脊髓損傷的頭端和尾端僅需7天即可發(fā)生解剖學(xué)上的重連，也有研究者通過組織學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在脊髓再生期的第7天，室管膜發(fā)生部分連續(xù)，在橫斷區(qū)至少在脊髓一側(cè)可見軸索；在再生期第28天，室管膜上皮和管腔幾乎已正常連續(xù)，且軸索重建[12].這與本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果相符合.期待此動(dòng)物模型能為東方蠑螈脊髓損傷再生的分子細(xì)胞機(jī)制研究提供基礎(chǔ)，找到哺乳動(dòng)物無法再生的原因，進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)人類脊髓損傷的再生醫(yī)學(xué)實(shí)踐謀福音.