檸檬烯異構(gòu)體的氣相色譜手性拆分和定量分析

武 鵬，石凱威，高歆越，姜宜飛，吳進(jìn)龍*，王詩(shī)雨

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100193)

1 前言

檸檬烯屬于單環(huán)單萜類(lèi)化合物，化學(xué)名稱(chēng)為1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，具有三種同分異構(gòu)體，分別為右旋檸檬烯、左旋檸檬烯和消旋檸檬烯[1，2]，不同構(gòu)型的檸檬烯的生物活性存在差異[3]，目前登記的檸檬烯有效成分均為d-檸檬烯，但已報(bào)到的檸檬烯分析方法如氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-7]均不能對(duì)檸檬烯進(jìn)行手性拆分。本文采用氣相色譜法對(duì)檸檬烯中的l-檸檬烯和d-檸檬烯進(jìn)行手性拆分和定量分析，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，分離效果好，準(zhǔn)確度和精密度均能達(dá)到定量分析的要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 丙酮(色譜純)；苯甲酸甲酯(分析純)；內(nèi)標(biāo)溶液：稱(chēng)取苯甲酸甲酯0.05g(精確至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，備用；d-檸檬烯標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%(sigma-aldrich)；l-檸檬烯標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%(sigma-aldrich)；5%d-檸檬烯可溶液劑(由某公司提供)。

2.2 儀器氣相色譜儀 Agilent 7890A，具有氫火焰離子檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：30m×0.25mm(id) RestekRt-βDEXse毛細(xì)管色譜柱，膜厚0.25μm。

2.3 氣相色譜操作條件 溫度(℃)：柱室溫度：初始80℃，保留15min，以20℃/min升溫至220℃，保留5min；氣化室溫度：220℃，檢測(cè)室溫度：240℃，載氣(N2)：1.0mL/min；氫氣：30mL/min，空氣：300mL/min，進(jìn)樣體積：1μL，分流比：10：1，保留時(shí)間：d-檸檬烯約13.0min；l-檸檬烯約12.5min；內(nèi)標(biāo)物約18.3min。

d-檸檬烯標(biāo)樣、l-檸檬烯標(biāo)樣、內(nèi)標(biāo)物和5%d-檸檬烯可溶液劑的氣相色譜圖(圖1、2)。

圖1 l-檸檬烯、d-檸檬烯標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)物氣相色譜圖

圖2 5%d-檸檬烯可溶液劑和內(nèi)標(biāo)物氣相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱(chēng)取l-檸檬烯標(biāo)樣0.05g(精確至0.000 2g)，置于100mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；移取1.0mL上述溶液于10mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；稱(chēng)取d-檸檬烯標(biāo)樣0.05g(精確至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻；移取1.5mLl-檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液和1mLd-檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10mL容量瓶中，加入2mL內(nèi)標(biāo)液，再用丙酮稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱(chēng)取含d-檸檬烯的試樣0.1g(精確至0.000 2g)，置于10mL容量瓶中，加入2mL內(nèi)標(biāo)液，再用丙酮稀釋至刻度，超聲3min，搖勻，冷卻，備用。

2.4.3 測(cè)定在上述操作條件下 待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液的響應(yīng)值相對(duì)變化<1.5%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.4 計(jì)算 將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)，按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

r1——標(biāo)樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；

r2——試樣溶液中d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的平均值；

m1——標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g；

P——標(biāo)樣中d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

n——稀釋倍數(shù)，n(l-檸檬烯)=2000/3，n(d-檸檬烯)=10。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇 因d-檸檬烯和l-檸檬烯屬于旋光異構(gòu)體，且二者的沸點(diǎn)差異不大，采用常規(guī)的色譜柱不能進(jìn)行有效拆分，且二者的碎片離子峰是一致的，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也不能進(jìn)行有效拆分[4-7]，本方法采用RestekRt-βDEXse手性毛細(xì)管色譜柱對(duì)檸檬烯進(jìn)行拆分；依據(jù)檸檬烯物化性質(zhì)，用丙酮作為溶劑溶解樣品，為了得到更好的分離效果和峰形，用不同的升溫條件在色譜柱上進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定溫度(℃)：初始80℃，保留15min，以20℃/min升溫至220℃，保留5min；在該條件下，d-檸檬烯和l-檸檬烯進(jìn)行了有效拆分，且與雜質(zhì)能得到很好的分離，峰形對(duì)稱(chēng)，基線平穩(wěn)，能在短時(shí)間得到滿(mǎn)意的分析結(jié)果，提高了工作效率。

3.2 分析方法的線性相關(guān)性試驗(yàn) 按2.4.1中標(biāo)樣溶液的配制方法分別配制質(zhì)量濃度為5.07、25.35、50.70、253.49、506.98、1013.96mg/L的l-檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為5.08、25.41、50.83、254.13、508.27、1016.53mg/L的d-檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以d-檸檬烯(l-檸檬烯)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，d-檸檬烯(l-檸檬烯)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制校正曲線。試驗(yàn)測(cè)得d-檸檬烯線性方程為y=1.277 95x+1.989 97，相關(guān)系數(shù)為0.996 89；l-檸檬烯線性方程為y=1.182 53x+1.774 80，相關(guān)系數(shù)為0.996 88。結(jié)果表明d-檸檬烯和l-檸檬烯在測(cè)試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 分析方法的精密度試驗(yàn) 從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱(chēng)取5個(gè)試樣，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得d-檸檬烯的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.066，變異系數(shù)為0.013%，l-檸檬烯的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 17，變異系數(shù)為0.023%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 從已知d-檸檬烯(5.20%)和l-檸檬烯(0.007 5%)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品中稱(chēng)取5個(gè)試樣，分別加入一定量的d-檸檬烯標(biāo)樣(99.0%)和l-檸檬烯標(biāo)樣(99.0%)，在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得d-檸檬烯的平均回收率為100.41%，l-檸檬烯的平均回收率為101.72%(表2)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

試驗(yàn)建立了氣相色譜法手性拆分檢測(cè)d-檸檬烯和l-檸檬烯的分析方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，d-檸檬烯和l-檸檬烯在測(cè)試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法準(zhǔn)確度和精密度較高，具有操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，是產(chǎn)品質(zhì)量控制和應(yīng)用研究中較為理想的分析方法。