波紋龍蝦對亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

梁妃爽，梁華芳，卓宏標(biāo)，孫榕澤，王潘妹，溫崇慶

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

近年來，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析甲殼動(dòng)物在惡劣環(huán)境脅迫下的分子機(jī)制研究越來越受到人們的重視。周錢森[9]對錦繡龍蝦Panulirusornatus在氨氮質(zhì)量濃度為20 mg/L脅迫下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選出一系列免疫和代謝相關(guān)基因，并推測高濃度氨氮導(dǎo)致錦繡龍蝦機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。董麗君等[10]對凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei進(jìn)行低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)低溫能夠影響凡納濱對蝦的免疫系統(tǒng)和相關(guān)代謝途徑, 推測谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)和 C-型凝集素等差異表達(dá)基因參與了低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。Li等[11]對凡納濱對蝦進(jìn)行低pH脅迫轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出57個(gè)與酸堿滲透壓有關(guān)基因。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道了日本囊對蝦Marsupenaeusjaponicus[12]、日本沼蝦Macrobrachiumnipponense[13]和凡納濱對蝦[14]等甲殼動(dòng)物對亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，挖掘了較多功能基因，為基因功能的進(jìn)一步研究提供了大量的數(shù)據(jù)。

目前，關(guān)于波紋龍蝦的研究主要集中在繁殖生物學(xué)[2]、微生物學(xué)[15]、群體遺傳學(xué)[16]和養(yǎng)殖[17]等方面，對其免疫、代謝等在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行的亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)機(jī)理研究未見報(bào)道。本研究中，分析了亞硝酸鹽脅迫下波紋龍蝦轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異，探討了環(huán)境脅迫對波紋龍蝦重要調(diào)控基因的影響，以期為進(jìn)一步挖掘相關(guān)功能基因、開發(fā)分子標(biāo)記等提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用波紋龍蝦幼蝦購自海南瓊海市青葛村，體質(zhì)量為(39.00±5.31) g，采用干運(yùn)法運(yùn)回廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地，在20 m3水泥池中暫養(yǎng)，用黑色幕布遮光，24 h不間斷充氣。試驗(yàn)海水取自自然海區(qū)，鹽度為26～30，pH為8.1～8.3，每天換水50%，投喂菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum等鮮活餌料，暫養(yǎng)3周后開始正式試驗(yàn)。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.2 RNA提取與質(zhì)控 利用Trizol法分別對建庫及定量試驗(yàn)所用波紋龍蝦組織進(jìn)行RNA提取，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析RNA純度和完整性，采用Agilent 2100軟件檢測RNA的完整性，采用Qubit 2.0軟件定量RNA濃度，采用Nanodrop軟件檢測RNA的純度，并選擇符合測序標(biāo)準(zhǔn)的RNA等量混合用于文庫建設(shè)。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 采用SMRTlink 7.0軟件(https://www.pacb.com/support/software-downloads)分析和處理原始數(shù)據(jù)；采用LoRDEC 0.7軟件(http://atgc.lirmm.fr/lordec)校正轉(zhuǎn)錄本；采用Cd-hit 4.6.8軟件(https://github.com/weizhongli/cdhit)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本去冗余；采用Bowtie2 2.3.4軟件(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本比對；采用RSEM 1.3.0軟件(http://deweylab.github.io/RSEM/)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析；采用DESeq 2軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)進(jìn)行差異表達(dá)分析，以顯著性差異P<0.05且差異倍數(shù)|log2(fold change)|>1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)；采用GOseq 1.10.0軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq. html)對亞硝酸鹽脅迫組和對照組差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析；采用KOBAS 3.0軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)進(jìn)行KEGG富集分析。

1.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證 從差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)、細(xì)胞分裂周期蛋白42(cell division control protein 42，cdc42)等9個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物(表1)，引物送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in qRT-PCR experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用2-△△Ct法計(jì)算亞硝酸鹽脅迫組、對照組基因的相對表達(dá)量，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

正常水質(zhì)條件和亞硝酸鹽脅迫下波紋龍蝦肝胰腺的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)見表2。從表2可見：測序獲得的原始數(shù)據(jù)總量為137.22 G，過濾后得到的數(shù)據(jù)量為128.57 G；堿基GC含量為33.76%～48.26%，各組織樣品Q20堿基百分比≥97.86%，Q30堿基百分比≥93.22%。這表明，測序產(chǎn)出質(zhì)量符合要求，可用于后續(xù)組裝分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)情況Tab.2 Data statistics of transcriptome

2.2 差異表達(dá)基因分析

在P<0.05 且|log2(foldchange)|>1條件下,使用DESeq 2軟件進(jìn)行亞硝酸鹽脅迫的差異表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEG)數(shù)量共有264個(gè)，其中，表達(dá)上調(diào)的基因有86個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有178個(gè)，并對差異表達(dá)基因分析結(jié)果繪制火山圖(圖1)。

圖1 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.1 Number of differentially expressed genes (DEG)

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

為深入了解波紋龍蝦在亞硝酸鹽脅迫下的調(diào)控機(jī)制，對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，將所有差異基因歸類3大分支：細(xì)胞組分、生物學(xué)過程和分子功能。從圖2可見：細(xì)胞組分以膜、細(xì)胞部分和細(xì)胞為主；生物學(xué)過程以代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物體過程等功能為主；分子功能以結(jié)合、催化活性和蛋白結(jié)合為主。在亞硝酸鹽脅迫下，結(jié)合、催化活性和代謝過程等調(diào)控過程中差異基因富集較為顯著，這表明波紋龍蝦肝胰腺組織中產(chǎn)生了大量參與機(jī)體細(xì)胞活動(dòng)和代謝等過程的基因。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG注釋和富集分析

將波紋龍蝦亞硝酸鹽脅迫組與對照組的差異表達(dá)基因(264個(gè))進(jìn)行KEGG注釋，結(jié)果顯示，有445個(gè)差異表達(dá)基因被注釋在181個(gè)代謝通路中，這是某些差異基因被注釋到多個(gè)通路的結(jié)果。其中，黏著斑、癌癥蛋白多糖、細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵襲、癌癥通路、緊密連接和志賀氏病等被注釋到的基因數(shù)量較多(表3)。

通路的富集程度由富集因子和P值共同決定，富集因子值越大富集程度就越高，P值越小富集顯著性就越顯著。在KEGG所有代謝通路中篩選出20條顯著富集通路，其中，富集程度最為顯著的是黏著斑、白細(xì)胞跨內(nèi)皮層遷移、胰島素抵抗、淀粉與蔗糖代謝等代謝通路(表4)。

2.5 KEGG顯著富集的信號(hào)通路展示

對顯著富集的癌癥通路進(jìn)行展示，部分如圖3所示，在該通路中標(biāo)紅色的基因表示差異顯著基因。其中，F(xiàn)ilamin(菲拉明)和paxillin(茯苓素)基因有兩個(gè)亞型，KEGG通路編號(hào)分別為ko4337和ko5760，其余α2β1(集成素α2)、α5β1(集成素α5)、cdc42(細(xì)胞分裂周期蛋白42)、F-actin/actin(肌動(dòng)蛋白β)、HIFIα(低氧誘導(dǎo)因子1α)和casp3(卡西普酶3)分別只有一個(gè)亞型基因。

圖2 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

表4 KEGG富集部分結(jié)果Tab.4 Partial results of KEGG enrichment

2.6 熒光定量 PCR驗(yàn)證

從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取catC1、catC2、β-G、S/T-P-P、actin-3、MS、CA、cdc42、NF-K-B共9個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證，比較結(jié)果如圖4所示，熒光定量PCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，這表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)具有一定的可信度。

圖3 部分癌癥蛋白多糖通路圖Fig.3 Part picture of cancer proteoglycan pathway

3 討論

3.1 波紋龍蝦轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析

近年來，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，環(huán)境因子的改變已成為影響甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖產(chǎn)生的主要因素，亞硝酸鹽是環(huán)境變化的一個(gè)主要污染物，給養(yǎng)殖中的蝦類帶來許多不良的影響[6]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已在水產(chǎn)甲殼動(dòng)物的發(fā)育、免疫和生長研究中發(fā)揮著重要作用[18]。本研究中，亞硝酸鹽脅迫下波紋龍蝦肝胰腺組織中參與脅迫響應(yīng)相關(guān)的差異基因涉及能量代謝、生長及免疫等多個(gè)生物學(xué)過程。

沈曄等[19]對脊尾白蝦Exopalaemoncarinicauda低鹽脅迫度響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，最顯著變化的GO通路為水解酶活性、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等，顯著變化的KEGG通路有賴氨酸生物合成、溶酶體、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路和色氨酸代謝等。曹梅等[20]對脊尾白蝦低氧脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，顯著變化的KEGG通路有核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工等。周錢森[9]對錦繡龍蝦氨氮脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，顯著變化的KEGG通路有精氨酸生物合成、溶酶體通路、Toll樣受體通路、丙氨酸代謝及天冬氨酸與谷氨酸代謝等。Guo等[21]對凡納濱對蝦進(jìn)行亞硝酸鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，得到 1 922個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因主要富集在免疫防御、異種生物的生物降解與代謝、氨基酸與核堿代謝過程和細(xì)胞凋亡等通路。本研究中，對波紋龍蝦響應(yīng)亞硝酸鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，顯著差異的GO通路為結(jié)合、催化活性、代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物過程等，顯著變化的KEGG通路有黏著斑、癌癥蛋白多糖、細(xì)菌對上皮細(xì)胞侵襲、癌癥通路和緊密連接等，其中，注釋到緊密連接通路的差異表達(dá)基因最多(9條)。物種差異和脅迫的條件及時(shí)間不同，導(dǎo)致對其影響的方式、作用部位和相對應(yīng)的通路也有所差異，也有可能是不同測序公司對差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)不同，導(dǎo)致不同研究者得出的結(jié)果有所差異。

圖4 轉(zhuǎn)錄組測序的qRT-PCR 驗(yàn)證Fig.4 Verification of transcriptome sequencing by qRT-PCR

3.2 波紋龍蝦對亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)的相關(guān)基因分析

3.2.1 波紋龍蝦的代謝響應(yīng) 本研究中KEGG富集顯示，波紋龍蝦在亞硝酸鹽脅迫下所產(chǎn)生的差異基因在代謝相關(guān)的通路被顯著富集，如淀粉與蔗糖代謝、氨基酸糖與核苷酸糖代謝及氮素代謝等通路，GO 功能富集分析也顯示，細(xì)胞代謝和有機(jī)生物代謝等過程被富集。這與對錦繡龍蝦氨氮脅迫轉(zhuǎn)錄組的富集結(jié)果相似[9]。其中，具有代表性的差異基因是谷氨酰胺和碳酸酐酶基因，谷氨酰胺基因在脅迫下顯著上調(diào)，推測其在機(jī)體的排毒機(jī)制中起著重要作用；而碳酸酐酶基因是維持機(jī)體酸堿平衡的重要成員，能夠排除體內(nèi)多余的CO2[22], 這說明亞硝酸鹽脅迫影響了波紋龍蝦機(jī)體的滲透壓平衡和呼吸排泄作用。此外還發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽脅迫下差異基因在甘油酯代謝和脂肪酸降解等通路中富集。對錦繡龍蝦和日本囊對蝦轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)，差異基因在甘油酯代謝和脂肪酸降解等通路富集[9,12]。推測在亞硝酸鹽脅迫下，脂類代謝活動(dòng)增強(qiáng)，通過不斷提供能量以便機(jī)體響應(yīng)亞硝酸鹽脅迫。

3.2.2 波紋龍蝦的生長響應(yīng) 本研究中通過對波紋龍蝦亞硝酸鹽脅迫差異表達(dá)基因KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌、胰島素抵抗和胰島素信號(hào)等通路顯著富集，主要參與了波紋龍蝦的生長調(diào)控，參與生長調(diào)控的基因有絲氨酸/蘇氨酸、肌動(dòng)/肌球蛋白和細(xì)胞分裂周期蛋白42(cdc42)等。絲氨酸/蘇氨酸基因具有一種獨(dú)特的作用，不僅能夠連接肌動(dòng)/肌球蛋白骨架和cdc42[23]，而且還能夠調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子1(IGF)的分泌，對促進(jìn)細(xì)胞生長具有重要作用[24]。此外，絲氨酸/蘇氨酸基因還參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和腫瘤形成等過程[23-25]。cdc42基因?qū)?xì)胞生長、增殖和黏附有重要作用，參與了機(jī)體的生長過程[26]。波紋龍蝦的生長調(diào)控受到多種基因的共同作用，相關(guān)驗(yàn)證還需要進(jìn)一步開展。

3.2.3 波紋龍蝦的免疫響應(yīng) 本研究中，部分差異表達(dá)基因在白細(xì)胞跨內(nèi)皮層遷移、癌癥蛋白多糖、細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵襲、Toll樣受體通路、血小板活化和溶酶體通路等與機(jī)體免疫和損傷相關(guān)的通路得到顯著富集，相關(guān)基因數(shù)量較多，且這些基因顯著富集到較多的應(yīng)激相關(guān)通路，這說明波紋龍蝦在脅迫下產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)。組織蛋白酶是溶酶體中天冬氨酸蛋白酶家族的重要成員之一,可降解溶酶體中各種各樣的蛋白質(zhì)[27]。本研究中，β-葡萄糖醛酸酶基因在溶酶體通路中顯著下調(diào)，組織蛋白酶和β-葡萄糖醛酸酶基因是波紋龍蝦免疫信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵性成員；癌癥蛋白多糖通路在亞硝酸鹽脅迫下，參與該通路的差異基因數(shù)目最多，且差異基因表達(dá)明顯上調(diào)，其中，參與波紋龍蝦體內(nèi)相關(guān)免疫的茯苓素基因顯著上調(diào)，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，茯苓素基因具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無害的作用[28]，茯苓素基因還具有細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等作用。此外，富集在這些免疫通路的差異基因還有cdc42、集成素β1、Filamin和肌動(dòng)蛋白β等，它們均為波紋龍蝦亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)下的重要免疫分子。

4 結(jié)論

1)通過分析波紋龍蝦肝胰腺組織在亞硝酸鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽影響波紋龍蝦肝胰腺組織基因表達(dá)水平，差異基因主要富集在能量代謝、生長及免疫等多個(gè)通路。

2)通過熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因的表達(dá)情況，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相似，這說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有一定可行度。

3)亞硝酸鹽對波紋龍蝦的能量代謝、生長及免疫具有顯著影響，本試驗(yàn)結(jié)果為解析波紋龍蝦亞硝酸鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制提供了數(shù)據(jù)資料。