腺病毒介導(dǎo)的PDCD4基因過表達(dá)促進(jìn)腎癌BTG1蛋白的表達(dá)和786-O細(xì)胞的凋亡

徐　挺　胡俊彪　戴國平　吳慧玲　杜小文

(金華市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江　金華　321000)

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腺病毒介導(dǎo)的PDCD4基因過表達(dá)促進(jìn)腎癌BTG1蛋白的表達(dá)和786-O細(xì)胞的凋亡

徐挺胡俊彪戴國平吳慧玲杜小文

(金華市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江金華321000)

〔摘要〕目的探討過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒對腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞株(786-O)的影響及腎臟注射后對腎癌的治療效果。方法體外構(gòu)建過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒；培養(yǎng)786-O細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染腺病毒體外干預(yù)，觀察細(xì)胞的死亡情況；將SD大鼠隨機(jī)分為對照組和移植組，兩組均在前肢腋部皮下注射786-O細(xì)胞株構(gòu)建腎癌模型，造模14 d后，對照組瘤中注射0.1 ml D-Hanks，移植組則注射含1×1011vp/mL的表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒的D-Hanks 0.1 ml。結(jié)果體外觀察轉(zhuǎn)染病毒后，786-O細(xì)胞的生長活力下降，死亡率升高；體內(nèi)注射病毒后，可以觀察到腎臟中抑癌基因PDCD4的上調(diào)和BTG1 蛋白表達(dá)水平的升高。結(jié)論過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒注射治療腎癌具有可行性。

〔關(guān)鍵詞〕腎癌；PDCD4；腺病毒；786-O

加深對腎癌的深層認(rèn)知，從基因水平尋找突破口將是治療腎癌有效的途徑〔1,2〕。程序化凋亡因子(PDCD)4是一種抑癌基因，能夠通過啟動eIF4A、eIF4G達(dá)到抑制細(xì)胞生長的效果。癌組織中的PDCD4表達(dá)下降甚至缺失，提示我們上調(diào)PDCD4表達(dá)可能是啟動癌細(xì)胞凋亡的分子開關(guān)〔3〕。腺病毒是一種具有雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的病毒，但是卻無法整合進(jìn)入人細(xì)胞的基因組，這為臨床應(yīng)用分子手段提供了一種相對安全的載體〔4〕。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器雌性SD大鼠200 g左右。實(shí)驗(yàn)過程符合動物倫理要求。RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、顯微鏡(Zeiss)、電泳儀(Biorad)和酶標(biāo)儀(TECAN sunrise)等。

1.2方法

1.2.1786-O細(xì)胞的培養(yǎng)傳代將購買的786-O細(xì)胞株(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，上海)種植于培養(yǎng)瓶中，RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)含20%胎牛血清，于37℃恒溫箱培養(yǎng)。每當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，使用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒構(gòu)建腺病毒的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和合成由漢恒生物公司完成。

1.2.3過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒體外轉(zhuǎn)染786-O當(dāng)786-O長滿96孔板底部時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入100 mol 2 μl病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對照組加入2 μl D-Hanks。用MTT方法檢測786-O的生長活力情況。轉(zhuǎn)染病毒1、3、5、7 d后，各時(shí)間點(diǎn)做細(xì)胞的生長活力檢測。每孔加入MTT (5 mg/ml,即0.5% MTT) 50 μl和L-DMEM培養(yǎng)液450 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h。棄丟上清液，每孔加入DMSO 350 μl，脫色搖床上劇烈搖晃20 min。將每孔的DMSO溶液分別轉(zhuǎn)移到另一96孔板中，做3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上選擇波長490 nm，測定各孔的光密度值。以各分組為橫坐標(biāo)，光密度值(OD值)為縱坐標(biāo)，繪制786-O生長活力線條圖，并比較不同組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的生長活力。MTT方法檢測生長活力數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4SD鼠腎癌模型構(gòu)建和過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒輸注及其觀察建原位腎癌模型。將786-O通過胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，配制成1×106的細(xì)胞懸液，并打入大鼠前肢腋部皮下，制備細(xì)胞荷瘤。瘤體的取出和鑒定：14 d后，在無菌條件下處死裸鼠，剝離瘤體，生理鹽水中清洗，多聚甲醛固定，并將腫瘤組織切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，4%石蠟包埋組織塊，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察成瘤情況。注射病毒：實(shí)驗(yàn)組將過表達(dá)抑癌基因PDCD4的腺病毒30 μl使用微量注射器打入瘤體中。每注射5 μl，留針10 min，再取另一個(gè)注射點(diǎn)注射，重復(fù)以上操作直至注射完畢。

1.2.5PDCD4基因的表達(dá)RT-PCR引物：PDCD4，上游引物：5'-TCAGCGACAGTGGGAGT-3'；下游引物：5'-AGCACGGTAGCCTTAT-3'；β-actin上游引物：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物：5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′。Trizol試劑進(jìn)行細(xì)胞裂解,提取細(xì)胞總RNA后，進(jìn)行純度鑒定,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后經(jīng)PCR擴(kuò)增相應(yīng)的cDNA(公司Takara，貨號9109,RR047A和RR820A)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。

1.2.6Western印跡檢測B細(xì)胞易位基因1(BTG1)蛋白的表達(dá)情況。用10%的膠來分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下封閉，使用Mouse anti- BTG1(Abcam,ab50991)一抗孵育過夜，第2天用羊抗小鼠HRP孵育1 h后，加入顯色劑，曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1786-O細(xì)胞生長狀況體外培養(yǎng)的786-O細(xì)胞不斷增多，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形、成纖維細(xì)胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至接近融合時(shí)傳代。光鏡下細(xì)胞透亮，均勻生長在培養(yǎng)面上，胞體突起，胞界清楚，胞核飽滿。隨著細(xì)胞的傳代，細(xì)胞也逐漸趨于純化。見圖1。

2.2病毒轉(zhuǎn)染情況和786-O生長狀況體外轉(zhuǎn)染病毒后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞分別做RT-PCR,可以觀察到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的PDCD4基因表達(dá)(4.20±0.55)，明顯高于對照組(0.40±0.10，P<0.05),說明病毒轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染病毒后MTT法觀察到，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后，生長活力明顯下降，說明在腺病毒介導(dǎo)的PDCD4基因過表達(dá)狀態(tài)下，腎癌細(xì)胞的生長受到抑制。1 d時(shí)，兩組沒有差異，在3、5、7 d，實(shí)驗(yàn)組的生長活力明顯低于對照組(P<0.05)，見圖2。

2.3大鼠腎癌模型造模情況HE染色顯示腫瘤細(xì)胞囊腔內(nèi)纖維化，瘤細(xì)胞胞質(zhì)透明并且較溫和,間質(zhì)中可見少量平滑肌細(xì)胞，說明造模成功，能夠通過786-O細(xì)胞的皮下注射形成腎癌瘤體。

2.4大鼠瘤體中PDCD4和BTG1表達(dá)情況注射病毒后，實(shí)驗(yàn)組中PDCD4基因(6.41±0.94)和BTG1蛋白(1.35±0.30)表達(dá)水平均高于對照組(1.23±0.67,0.19±0.02)，說明我們構(gòu)建的腺病毒載體也能在體內(nèi)提高PDCD4基因，進(jìn)而提高BTG1 蛋白表達(dá)水平，見圖4。

圖1　體外培養(yǎng)的786-O細(xì)胞(×200，標(biāo)尺=20 μm)

與對照組比較：1)P<0.05圖2　兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長活力

圖3　兩組動物成瘤組織切片情況(HE，×100)

圖4　不同組瘤體中BTG1 蛋白量

3討論

腎癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的癌癥，其對放化療不敏感，患者術(shù)后多采取中醫(yī)藥等手段以防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。但絕大多數(shù)患者確診時(shí)，已經(jīng)處于癌癥晚期，僅能接收放化療，療效較差。因此，運(yùn)用最新的科學(xué)研究手段來輔助治療至關(guān)重要〔5〕。隨著精準(zhǔn)化醫(yī)學(xué)的倡導(dǎo)，基因治療作為一種新興的精準(zhǔn)的治療手段，逐漸被人們所關(guān)注。以病毒作為基因治療的手段，在世界范圍內(nèi)早已受到廣泛的研究，但是由于病毒的實(shí)際應(yīng)用存在著較大的安全隱患，導(dǎo)致了不少研究成果止步于實(shí)驗(yàn)室，而難以進(jìn)行下一步的臨床應(yīng)用〔6,7〕。腺病毒是一種廣為研究的病毒，由雙鏈DNA組成，由于其不整合進(jìn)細(xì)胞基因組，且不長期表達(dá)，對人不具有致癌性，而成為臨床應(yīng)用的首選〔8〕。早在2006年，CFDA批準(zhǔn)了基因改造的腺病毒H101用于治療頭頸癌。這種腺病毒的相對安全性，也為基因改造的臨床應(yīng)用提供可行性〔9〕。PDCD4是一種抑癌基因，它與細(xì)胞凋亡和腫瘤抑制息息相關(guān)。許多研究表明，PDCD4基因在前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤中表達(dá)量下降或者消失，這為PDCD4基因在腫瘤中作為治療靶點(diǎn)提供量依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景〔10~12〕。在腎透明細(xì)胞癌中，PDCD4基因處于低表達(dá)水平，并且表達(dá)量遠(yuǎn)低于正常組織〔13〕。我們將PDCD4基因作為一種評估透明細(xì)胞癌發(fā)展和預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，通過分子生物學(xué)手段，利用過表達(dá)PDCD4基因的腺病毒轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞，有效地提高腎癌細(xì)胞PDCD4基因表達(dá)水平，降低細(xì)胞的癌癥而化程度，啟動癌細(xì)胞死亡的機(jī)制，從而達(dá)到抑制癌癥惡化的作用。BTG1屬于BTG/TOB家族，具有抗增殖活性，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，因此，可以將BTG1蛋白作為一種癌細(xì)胞狀態(tài)的指證〔14〕。研究表明，BTG1能夠通過P53介導(dǎo)來調(diào)控細(xì)胞凋亡〔15〕。我們通過腺病毒來上調(diào)癌細(xì)胞的PDCD4基因表達(dá)，能夠進(jìn)一步提高BTG1蛋白的表達(dá)量，說明癌細(xì)胞正處在自我凋亡的狀態(tài)。但PDCD4和BTG1之間的相互作用機(jī)制還不明確，需要我們進(jìn)一步研究。

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〔2015-10-26修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1048-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.011

基金項(xiàng)目：金華市科學(xué)技術(shù)局資助課題(No.2013-3-057)

第一作者：徐挺(1980-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿系腫瘤研究。