基于焦亡相關(guān)基因的肝細(xì)胞癌臨床預(yù)后模型的建立和評(píng)估

劉川銘，李 謝，盧熙奎，曾點(diǎn)點(diǎn)，陳 潔

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；3.昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650041）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，約占所有病例數(shù)的75%~85%，5年存活率僅為18%〔1〕。HCC早期無特異癥狀，患者就診時(shí)多處于中晚期，預(yù)后較差。甲胎蛋白、分泌型蛋白Dickkopf-1和高爾基體蛋白73等生物標(biāo)志物對(duì)于HCC的診斷和預(yù)后并不理想〔2〕。T、N和M分期作為一種傳統(tǒng)的預(yù)后預(yù)測(cè)方法，由于其無法實(shí)現(xiàn)患者個(gè)體化的生存預(yù)測(cè)，故缺乏一定的準(zhǔn)確性。因此，確立新的預(yù)后模型對(duì)于HCC患者來說是非常重要的。

細(xì)胞焦亡作為一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和抗腫瘤免疫功能的激活有關(guān)，由于其介導(dǎo)了白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18等可能促進(jìn)癌癥進(jìn)展的炎癥介質(zhì)的釋放，因此有研究認(rèn)為細(xì)胞焦亡具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用〔3〕，且IL-1β可提高HCC中缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)水平，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔4〕。既往的研究〔5-6〕也顯示焦亡相關(guān)基因（pyroptosis-related genes，PRGs）可有效預(yù)測(cè)肺腺癌和卵巢癌等患者的預(yù)后情況。應(yīng)樂倩等〔7〕的研究表明細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)評(píng)分對(duì)預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后具有較高的準(zhǔn)確性，且預(yù)測(cè)預(yù)后的有效性不亞于現(xiàn)有的臨床病理指標(biāo)。

本研究基于與HCC預(yù)后密切相關(guān)的PRGs構(gòu)建了預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，該模型通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分來預(yù)測(cè)和評(píng)估HCC的預(yù)后，為HCC患者的臨床診斷和治療指導(dǎo)提供個(gè)體化的模型，同時(shí)結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與臨床特征繪制列線圖以提高預(yù)測(cè)預(yù)后的效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HCC患者數(shù)據(jù)的收集 在TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肝癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，共獲得50例正常樣本和374例HCC樣本，臨床數(shù)據(jù)主要包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、性別、分級(jí)、stage分期以及T、N和M分期。

1.1.2 PRGs表達(dá)量數(shù)據(jù)的獲取 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)〔5，8-11〕以 及 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中以“pyroptosis”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集到207個(gè)PRGs，利用“l(fā)imma”軟件包提取得到192個(gè)PRGs的表達(dá)量數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 PRGs的差異分析 利用R語(yǔ)言“l(fā)imma”軟件包中的“wilcox.test”篩選192個(gè)PRGs中具有顯著差異表達(dá)的焦亡相關(guān)基因（differential expression of pyroptosis-related genes，DEPRGs），篩選條件為|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05。

1.2.2 DEPRGs的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析 利用“org.Hs.eg.db”和“clusterProfiler”軟件包對(duì)DEPRGs進(jìn)行GO功能富集分析。將DEPRGs上傳至DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，篩選P＜0.01的條目。

1.2.3 HCC預(yù)后相關(guān)PRGs的確定 使用StrawberryPerl軟件將DEPRGs與臨床數(shù)據(jù)中的生存時(shí)間和生存狀態(tài)進(jìn)行合并，通過R語(yǔ)言中的“survival”軟件包單因素COX分析出與HCC預(yù)后相關(guān)的PRGs，顯著性過濾條件為P＜0.05。

1.2.4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的建立 采用R語(yǔ)言“survival”軟件包中的多因素COX分析進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)AIC值構(gòu)建最優(yōu)模型，獲得用于構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的基因，并得到相應(yīng)的回歸系數(shù)（Coef）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)量和多因素COX分析得到的回歸系數(shù)，建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（風(fēng)險(xiǎn)基因1的表達(dá)量×Coef1）+（風(fēng)險(xiǎn)基因2的表達(dá)量×Coef2）+（…）+（風(fēng)險(xiǎn)基因n的表達(dá)量×Coefn）。

1.2.5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的評(píng)估 以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為截?cái)嘀?，將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。采用K-M生存曲線評(píng)估高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的生存率，繪制受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線），根據(jù)ROC曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）評(píng)估模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。使用R語(yǔ)言對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素和多因素的獨(dú)立預(yù)后分析，并通過“rms”軟件包繪制基于風(fēng)險(xiǎn)模型的列線圖預(yù)測(cè)肝癌患者未來幾年的生存概率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用R語(yǔ)言和Perl語(yǔ)言包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及繪圖，基因表達(dá)量數(shù)據(jù)統(tǒng)一進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 識(shí)別顯著DEPRGs篩選得到了58個(gè)DEPRGs，其中55個(gè)顯著上調(diào)，分別為GSDMD、GSDME、GSDMB、GSDMC、NLRP1、CASP8、PYCARD、DHX9、NLRP9、CASP3、APIP、KCNQ1OT1、TREM2、MALAT1、GJA1、VDR、AGER、UTS2、CTSV、KLF3-AS1、BSG、IL32、CDKN2B-AS1、SQSTM1、IRF3、ADORA2A、METTL3、PECAM1、TRIM31、MIR25、MRE11、PARP1、MKI67、IL36G、VIM、BIRC3、LY96、GLMN、IRGM、NOS2、TP63、POP1、ANXA2、TLR9、ASIC1、CGAS、GAS5、NOD1、PLCG1、BAK1、BAX、CHMP3、CHMP4C、CYCS、IL1A；3個(gè)顯著下調(diào)，分別為IL1B、IL1RN、IL6。

2.2 DEPRGs的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果GO功能富集結(jié)果顯示，生物過程方面主要涉及細(xì)胞焦亡、脂多糖反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)IL-6的產(chǎn)生和對(duì)腫瘤壞死因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組成主要涉及膜筏、炎性復(fù)合體、膜微區(qū)；分子功能主要涉及IL-1受體結(jié)合、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合、磷脂酰肌醇磷酸結(jié)合。見表1。KEGG信號(hào)通路富集分析主要涉及NOD樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、非酒精性脂肪性肝病、Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、乙型肝炎、癌癥信號(hào)通路和腫瘤壞死因子信號(hào)通路等。見表2。

2.3 預(yù)后相關(guān)PRGs的篩選將58個(gè)DEPRGs的表達(dá)量數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)中的生存時(shí)間和生存狀態(tài)進(jìn)行合并，通過單因素COX分析過濾得到23個(gè)與HCC預(yù)后相關(guān)的PRGs。見表3。

2.4 PRGs預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的建立對(duì)23個(gè)預(yù)后PRGs進(jìn)行多因素COX分析，確定其與HCC患者的預(yù)后顯著相關(guān)，最終獲得了8個(gè)可用來構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的基因，分別為DHX9、TREM2、CTSV、BSG、SQSTM1、PARP1、GLMN和NOD1。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)量與多因素COX分析得到的回歸系數(shù)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。見表4。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（DHX9的表達(dá)量×0.443）+（TREM2的 表 達(dá) 量×0.135）+（CTSV的 表 達(dá) 量×0.224）+（BSG的表達(dá)量×0.228）+（SQSTM1的表達(dá)量×0.274）+（PARP1的表達(dá) 量×（-0.314））+（GLMN的表達(dá)量×0.608）+（NOD1的表達(dá)量×（-0.534））。

2.5預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的驗(yàn)證以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)作為截?cái)嘀祵⒒颊叻譃楦唢L(fēng)險(xiǎn)組（n=185）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=185），采用K-M生存曲線對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1A。風(fēng)險(xiǎn)曲線中患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分按升序排列，從左到右患者的風(fēng)險(xiǎn)值逐漸增大。見圖1B。患者的生存狀態(tài)則以散點(diǎn)圖的形式呈現(xiàn)，結(jié)合了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、生存時(shí)間和生存狀態(tài)，隨著風(fēng)險(xiǎn)值的增大患者的病死例數(shù)增多，風(fēng)險(xiǎn)值減小時(shí)患者的病死例數(shù)下降。見圖1C。

圖1 預(yù)后模型的風(fēng)險(xiǎn)分析

在單因素的獨(dú)立預(yù)后分析中，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間和生存狀態(tài)顯著相關(guān)（HR=1.411，P＜0.001）。多因素的獨(dú)立預(yù)后分析也顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間和生存狀態(tài)顯著相關(guān)（HR=1.352，P＜0.001），其他的臨床數(shù)據(jù)并不是獨(dú)立的預(yù)后因子（P>0.05）。見表5。此外，ROC曲線結(jié)果顯示，相較于其他臨床數(shù)據(jù)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC最高（0.802），表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)價(jià)值高于其他臨床數(shù)據(jù)。見表6。因此，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)測(cè)肝癌的臨床預(yù)后方面具有可靠性，可作為獨(dú)立預(yù)后因子。本研究通過將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與年齡、性別及T、N和M分期等臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，構(gòu)建了用于預(yù)測(cè)肝癌患者1、3、5年生存率的列線圖。見圖2。

圖2 肝癌患者預(yù)后的列線圖

表5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

表6 ROC曲線中各變量的AUC值

3 討論

HCC是臨床最常見的惡性腫瘤之一，盡管免疫療法和靶向療法等新的治療方法對(duì)其治療效果已有所提高，但患者5年的生存率仍然低于20%，許多患者確診時(shí)疾病已進(jìn)入晚期，患者的預(yù)后相對(duì)較差。生物信息學(xué)分析在闡明眾多差異表達(dá)基因的作用機(jī)制以及評(píng)估HCC發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性方面具有重要意義，目前生物信息學(xué)分析已被證明在許多腫瘤的診斷、治療和預(yù)后中都發(fā)揮著越來越重要的作用〔12〕。本研究利用單因素和多因素COX分析確定了8個(gè)與HCC預(yù)后顯著相關(guān)的PRGs，即BSG、CTSV、DHX9、GLMN、NOD1、PARP1、SQSTM1和TREM2基因。

BSG作為一種免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，又稱CD147或EMMPRIN，可參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在活化的淋巴細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)。BSG在大多數(shù)人類惡性腫瘤中過度表達(dá)，腫瘤細(xì)胞中的BSG活性被認(rèn)為是由腫瘤相關(guān)的與半乳糖凝集素-3、透明質(zhì)酸和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4等具有結(jié)合活性的多糖過度表達(dá)而增強(qiáng)〔13-14〕。BSG在腫瘤中的過度表達(dá)通常被認(rèn)為是一個(gè)不利的預(yù)后標(biāo)志〔13，15〕，其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及透明質(zhì)酸，進(jìn)而促進(jìn)這些細(xì)胞的遷移、增殖和血管生成〔16-17〕。Xu等〔18〕的研究結(jié)果顯示，CD147可通過促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65的磷酸化，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞中IL-1β與IL-18的表達(dá)和分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞焦亡。此外，有報(bào)道〔19〕HCC中組織蛋白酶L2（又稱CTSV）的mRNA和蛋白水平均有所增加，蛋白酶L2的表達(dá)升高與HCC的不良預(yù)后相關(guān)。Leng等〔20〕的研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）可增加膜穿孔蛋白D氨基末端的表達(dá)，沉默組織蛋白酶V可逆轉(zhuǎn)HMGB1誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡；HMGB1可增加溶酶體的通透性，而沉默組織蛋白酶V可減弱HMGB1誘導(dǎo)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）激活。

DEAH盒解旋酶9（DEAH-box helicase 9，DHX9）是一種依賴三磷酸核苷酸的RNA解旋酶，屬于DExD/H-Box超家族Ⅱ類解旋酶，它的過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)。Shi等〔21〕檢測(cè)了DHX9在肝癌組織中的表達(dá)及其在細(xì)胞中的功能，并進(jìn)一步分析了DHX9與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，研究結(jié)果提示DHX9可能是一個(gè)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的癌基因。此外，DHX9還可能在DNA介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，DHX9通過其DUF1605結(jié)構(gòu)域識(shí)別CpG-BDNA，并作為傳感器激活Ⅰ型干擾素反應(yīng)，將信號(hào)傳遞給免疫系統(tǒng)〔22〕。有研究〔23〕通過整合多個(gè)基因表達(dá)隊(duì)列開發(fā)了一個(gè)基于免疫相關(guān)基因的肝癌預(yù)后標(biāo)志，并通過獨(dú)立隊(duì)列和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該模型的穩(wěn)定性和可靠性，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)GLMN在腫瘤組織中的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平相較于癌旁組織顯著增加，且在GSE6764和GSE14520隊(duì)列中的差異表達(dá)結(jié)果也顯示GLMN在腫瘤中高表達(dá)。此外，Suzuki等〔24〕的研究發(fā)現(xiàn)GLMN-cIAPs軸控制著炎性小體的激活，而IpaH7.8-GLMN-cIAPs軸則是志賀氏菌促進(jìn)巨噬細(xì)胞焦亡并引起嚴(yán)重炎癥的獨(dú)特機(jī)制。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）1作為NOD樣受體亞家族NLRC中的主要代表與TLR、RIG樣受體和C型凝集素家族共同構(gòu)成了先天病原體模式識(shí)別系統(tǒng)。焦亡是Caspase-1依賴性炎癥細(xì)胞死亡的一種形式，也可發(fā)生在吞噬細(xì)胞中，作為炎性小體激活的結(jié)果。NLR的家族成員是炎癥體激活的核心成分，可作為與Caspase-1前體進(jìn)行蛋白相互作用的平臺(tái)。Guo等〔25〕的研究結(jié)果亦顯示吳茱萸堿對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用可能是通過抑制NOD1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)聚（ADP-核糖）聚合酶1（poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1）可激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子激活參與炎癥和癌細(xì)胞存活的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，PARP1還通過激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和c-Jun N-末端激酶信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移〔26〕。在卵巢癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和白血病等惡性腫瘤中，PARP1的mRNA、蛋白質(zhì)和酶活性水平都有所升高〔27-29〕。劉梅等〔30〕的研究發(fā)現(xiàn)PARP1作為碘化鉀誘導(dǎo)的高表達(dá)蛋白可參與調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性，并促進(jìn)炎癥性細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

Ichimura等〔31〕的研究發(fā)現(xiàn)p62S351位點(diǎn)的磷酸化顯著增加了其在選擇性自噬過程中與Keap1的結(jié)合親和力，磷酸化p62的聚集持續(xù)激活了核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）信號(hào)通路，將促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展。此外，SQSTM1基因的過度表達(dá)或異常聚集和磷酸化可導(dǎo)致葡萄糖和谷氨酰胺的代謝紊亂，并通過持續(xù)激活Nrf2促進(jìn)丙型肝炎病毒陽(yáng)性HCC的腫瘤發(fā)展〔32〕。在肝臟中，髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expresses on myeloid cells-2，TREM2）表達(dá)于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞〔33〕。TREM2在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中也有表達(dá)，可被募集到炎癥部位與常駐免疫細(xì)胞一起參與先天免疫調(diào)節(jié)。有研究通過單細(xì)胞RNA測(cè)序在人和小鼠纖維化的肝臟中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與瘢痕相關(guān)的巨噬細(xì)胞亞群，該亞群由TREM2+和CD9+識(shí)別，它們通過TNFRSF12A、PDGFR和NOTCH信號(hào)通路與內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞一起促進(jìn)肝臟的纖維化〔34〕。此外，在一項(xiàng)以HepG2細(xì)胞和HCC模型動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究中，TREM2通過誘導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為〔35〕。

綜上所述，本研究建立了一個(gè)基于8個(gè)焦亡相關(guān)基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，單因素和多因素COX分析表明該預(yù)后模型計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)值可作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，在ROC曲線中該模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC值（0.802）為最高，表明其預(yù)測(cè)價(jià)值要明顯優(yōu)于其他臨床數(shù)據(jù)，此外又構(gòu)建了可用于預(yù)測(cè)結(jié)局事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的列線圖以提高預(yù)測(cè)預(yù)后的效率。在后續(xù)的研究中，將通過體外的細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步的驗(yàn)證。