賴氨酰氧化酶家族蛋白質(zhì)與胃癌相關(guān)性的研究進(jìn)展

熊 偉，李 彬，王播勇，劉如愛(ài)，姜 北，自加吉，周靜華*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其病死率在全球范圍內(nèi)排惡性腫瘤致死率的第3位〔1〕。雖然近年來(lái)胃癌的臨床診療得到了迅速發(fā)展，但術(shù)后患者的預(yù)后非常差。由于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，晚期胃癌患者的5年生存率遠(yuǎn)低于10%〔2〕。因此，有必要了解胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，以確定有效的臨床治療靶點(diǎn)。目前，越來(lái)越多的研究表明，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）家族蛋白質(zhì)在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，但其在胃癌中的具體作用及分子機(jī)制尚不完全清楚。本文就LOX家族各個(gè)成員與胃癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性作一綜述，以期發(fā)現(xiàn)可用于胃癌治療的LOX家族蛋白質(zhì)成員的特異性抑制劑。

1 LOX家族蛋白質(zhì)的概述

LOX家族蛋白質(zhì)是一類分泌型銅依賴性胺氧化酶，具有催化彈性蛋白和膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）共價(jià)交聯(lián)的作用。LOX催化ECM彈性蛋白和膠原蛋白中賴氨酸和羥賴氨酸殘基的氧化脫氨基反應(yīng)，產(chǎn)物形成分子間和分子內(nèi)交聯(lián)，這種分子間縮合將彈性蛋白或膠原蛋白的可溶性單體轉(zhuǎn)化為ECM中的不可溶性纖維，并能抵抗非特異性蛋白水解酶所引起的彈性蛋白分解和膠原溶解，從而起到穩(wěn)定ECM的作用〔3-4〕。人類有4種LOX同工酶，與LOX具有部分結(jié)構(gòu)同源性，即賴氨酰氧化酶樣蛋白1~4（lysyl oxidase like 1~4，LOXL1~4），這5個(gè)成員共同構(gòu)成LOX蛋白家族〔5〕。人類LOX家族蛋白的編碼基因分別定位于5、15、8、2和10號(hào)染色體上〔6〕。其中，LOX基因編碼的mRNA開(kāi)放閱讀框最短，編碼417個(gè)氨基酸，而LOXL2基因編碼的mRNA開(kāi)放閱讀框最長(zhǎng)，編碼774個(gè)氨基酸〔7〕。LOXL1~4蛋白分別與LOX蛋白具有85%、58%、65%和62%的同源性。見(jiàn)表1。LOX家族成員都具有催化活性。5個(gè)家族成員的C端區(qū)域具有95%的同源性，由高度保守的205個(gè)氨基酸組成，該催化區(qū)域包括銅結(jié)合位點(diǎn)、賴氨酸酪氨?；珰埢图?xì)胞因子受體樣結(jié)構(gòu)域〔8〕，對(duì)它們的生物活性至關(guān)重要。然而，這些家族成員的N端序列卻是多樣性的，LOX和LOXL1蛋白含有前結(jié)構(gòu)域，LOXL2~LOXL4蛋白各自含有4個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的清道夫受體，這可能決定它們的亞細(xì)胞定位或介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用〔9-10〕。

LOX家族蛋白質(zhì)的表達(dá)具有高度組織特異性。LOX蛋白在胎盤、睪丸、心臟、肺、腎臟和子宮中高表達(dá)，而在肝臟和大腦中只有很低的表達(dá)〔11〕；LOXL1蛋白在胚胎、肌肉、腎臟、心臟、肺和胰臟中高表達(dá)，但在肝臟和大腦中的表達(dá)也相對(duì)較低〔11〕；LOXL2蛋白在胎盤和子宮等組織中的表達(dá)很高，在肝臟和大腦中的表達(dá)也很低〔12〕；LOXL3蛋白在睪丸、脾臟、前列腺中高表達(dá)，在胚胎中的表達(dá)居中，在肝臟中幾乎不表達(dá)〔13-14〕；LOXL4蛋白是整個(gè)蛋白家族在肝臟中唯一高表達(dá)的成員〔15〕。見(jiàn)表1。

2 LOX及LOXL1~4蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性

2.1 LOX蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性胃癌是發(fā)展中國(guó)家中發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一〔16〕。在胃癌組織中檢測(cè)到LOX基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于鄰近的正常胃組織，并且與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)狀態(tài)和T、N、M分期有關(guān)〔17〕。Kasashima等〔18〕發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞和組織中的LOX基因mRNA和蛋白質(zhì)在缺氧條件下的表達(dá)水平顯著高于常氧條件下的表達(dá)水平。此外，LOX蛋白的表達(dá)水平與胃癌患者的浸潤(rùn)深度、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤(rùn)、靜脈浸潤(rùn)、腹膜轉(zhuǎn)移等具有顯著相關(guān)性，提示LOX基因高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后不良〔19〕。LOX蛋白與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在胃癌不同進(jìn)展期中的表達(dá)呈正相關(guān)，因此可以推測(cè)兩者在胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中具有相互協(xié)同作用，可能是由于VEGF的異常表達(dá)，引起ECM出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致LOX蛋白的異常表達(dá)〔20〕。通過(guò)siRNA靶向和調(diào)低LOX基因能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并降低缺氧條件下胃癌細(xì)胞的遷移能力〔18〕。同樣，Peng等〔19〕研究表明，與腫瘤周圍的組織相比，LOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并且與漿膜浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及晚期胃癌有關(guān)。此外，局部區(qū)域復(fù)發(fā)患者的LOX蛋白表達(dá)水平高于遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)患者。考慮到LOX蛋白與基質(zhì)硬度之間的關(guān)系，研究〔20〕顯示巨噬細(xì)胞密度、微血管密度、微血管成熟、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)水平和Ⅳ型膠原表達(dá)水平在過(guò)表達(dá)LOX基因后均顯著地升高，表明LOX蛋白激活了癌細(xì)胞并促進(jìn)了胃癌的發(fā)展。將LOX蛋白與腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原、糖類抗原19-9、糖類抗原125和糖類抗原724結(jié)合可以顯著提高預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移的敏感性〔21〕。然而，一項(xiàng)研究〔22〕表明，由于人類胃癌組織中的DNA甲基化和雜合性喪失，LOX基因表達(dá)下調(diào)，并且LOX蛋白對(duì)胃癌發(fā)揮了抑制作用。因此，需要進(jìn)一步探索LOX蛋白在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

2.2 LOXL1蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性LOXL1反義RNA1（LOXL1-AS1）基因位于人類染色體15q24.1上，由10 781個(gè)核苷酸和5個(gè)外顯子組成。Sun等〔23〕的研究揭示，LOXL1-AS1基因在胃癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)，LOXL1-AS1蛋白的上調(diào)可預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后不良，其研究結(jié)果表明，LOXL1-AS1基因通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、EMT和退分化加速胃癌的惡化。LOXL1-AS1基因在體內(nèi)也能促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖。在功能上，LOXL1-AS1基因作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA通過(guò)分泌miR-708-5p上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子USF1。此外，該研究還證實(shí)LOXL1-AS1/miR-708-5p/USF1通路在胃癌進(jìn)展中起促進(jìn)作用，USF1促進(jìn)了干細(xì)胞標(biāo)記SOX2的轉(zhuǎn)錄。

有研究〔24〕顯示，LOXL1基因在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且與胃癌預(yù)后差顯著相關(guān)?；蚣患治鲲@示，LOXL1基因表達(dá)與參與EMT過(guò)程的基因表達(dá)呈正相關(guān)。與普通胃癌患者的腫瘤組織和細(xì)胞相比，LOXL1基因在腹膜擴(kuò)散胃癌患者的腫瘤組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。LOXL1基因過(guò)表達(dá)降低E-鈣黏蛋白（CDH1）表達(dá)，增加VIM、CDH2、SNAI2和PLS3蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移能力。而且過(guò)表達(dá)LOXL1蛋白的胃癌細(xì)胞將它們的形態(tài)改變?yōu)榧忓N狀形式。此外，LOXL1基因mRNA高表達(dá)與低分化的組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且是一個(gè)預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔24〕。還有研究〔25〕表明，LOXL1基因的表達(dá)水平在不同臨床病理學(xué)特征之間存在差異，在T分期較晚的胃癌患者中，LOXL1基因呈更高的表達(dá)水平。LOXL1蛋白可以通過(guò)WNT/β-catenin/cyclinD1信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，但并不影響胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。以上研究結(jié)果提示，LOXL1蛋白在胃癌中主要發(fā)揮促癌作用。

2.3 LOXL2蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性Zhou等〔26〕在胃癌基質(zhì)細(xì)胞中觀察到LOXL2基因的過(guò)表達(dá)。基質(zhì)細(xì)胞中LOXL2基因的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴浸潤(rùn)、靜脈浸潤(rùn)和腹膜播散顯著相關(guān)。多因素回歸分析顯示，基質(zhì)細(xì)胞中LOXL2基因的表達(dá)水平可能是胃癌患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。來(lái)自基質(zhì)成纖維細(xì)胞的LOXL2蛋白也促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移。更重要的是，LOXL2基因高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)〔27〕。與正常上皮組織相比，LOXL2基因在原發(fā)癌組織中的表達(dá)顯著升高，并且與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，預(yù)示著胃癌患者的總體預(yù)后較差。此外，在與原發(fā)性胃癌相關(guān)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中也檢測(cè)到LOXL2基因的表達(dá)。shRNA誘導(dǎo)的LOXL2基因沉默和抗LOXL2抗體降低了胃癌細(xì)胞的侵襲、黏附和轉(zhuǎn)移能力。相反，LOXL2基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的侵襲和黏附。此外，分泌型的LOXL2蛋白通過(guò)激活Src/FAK通路促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔28〕。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，LOXL2蛋白在胃癌中發(fā)揮促癌作用。

2.4 LOXL3蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性最近對(duì)LOXL3蛋白的研究〔29〕發(fā)現(xiàn)，除了作為胺氧化酶外，LOXL3蛋白還發(fā)揮著各種新的作用。LOXL3蛋白通過(guò)與SNAIL（一種參與EMT過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子）發(fā)生相互作用，在抑制CDH1基因表達(dá)中發(fā)揮作用。LOXL3蛋白與核周膜中SNAIL蛋白的相互作用能協(xié)同下調(diào)CDH1蛋白的表達(dá)，從而表明LOXL3蛋白參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。此外，SNAIL蛋白Ser11位點(diǎn)的磷酸化受蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）調(diào)節(jié)，PKD1促進(jìn)LOXL3蛋白的上調(diào)及其與SNAIL蛋白的相互作用〔30〕。SNAIL蛋白Ser11位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致與組蛋白脫乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）以及LOXL3蛋白結(jié)合。磷酸化的SNAIL蛋白與HDAC1和HDAC2形成的復(fù)合物在細(xì)胞核中穩(wěn)定，并促進(jìn)腫瘤增殖標(biāo)記物的上調(diào)，如細(xì)胞周期蛋白D1和AJUBA蛋白〔30〕。

LOXL3基因mRNA在心臟、脾臟、子宮、髓質(zhì)、脊髓和卵巢中的表達(dá)水平最高〔14，31〕。LOXL3和LOXL4基因mRNA在侵襲能力強(qiáng)的彌漫型胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增高。LOXL3蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，主要表達(dá)于細(xì)胞核〔32〕。LOXL3基因表達(dá)升高與胃癌浸潤(rùn)、淋巴和靜脈浸潤(rùn)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。與LOXL3蛋白陰性表達(dá)的胃癌患者相比，LOXL3蛋白陽(yáng)性胃癌患者的臨床結(jié)局不佳〔33〕。另外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在胃癌細(xì)胞中能夠誘導(dǎo)LOXL3蛋白表達(dá)上調(diào)，表明LOXL3蛋白是TGF-β信號(hào)通路的下游分子。然而，仍然需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證LOXL3蛋白在胃癌中的致癌作用。

2.5 LOXL4蛋白與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性LOXL4蛋白具有抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤，調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和衰老，誘導(dǎo)細(xì)胞趨化性等作用。LOXL4蛋白在腫瘤發(fā)生過(guò)程中形成免疫抑制微環(huán)境〔34〕。LOXL4蛋白還可以通過(guò)外泌體形式促進(jìn)自身的遷移及上皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管的形成，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移〔35〕。

目前，LOXL4蛋白被報(bào)道為胃癌中的促癌蛋白〔36〕。LOXL4蛋白表達(dá)在胃癌組織中高于配對(duì)的非癌組織，并且與腫瘤大小、癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T、N、M分期呈正相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)胃癌患者的不良臨床結(jié)局。此外，LOXL4基因的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并通過(guò)激活Src/FAK信號(hào)通路促進(jìn)ECM黏附。與此一致的是，調(diào)低LOXL4基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。TGF-β是腫瘤細(xì)胞中LOXL4蛋白表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以誘導(dǎo)LOXL4蛋白的表達(dá)。研究〔33〕顯示，TGF-β能夠降低胃癌細(xì)胞LOXL1蛋白表達(dá)并增加LOXL3和LOXL4蛋白的表達(dá)。LOXL4蛋白可能是胃癌的一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

胃癌對(duì)人類健康的危害很大，患者治療效果差和預(yù)后差的原因主要有兩個(gè)方面:一方面是診斷和發(fā)現(xiàn)不及時(shí)，大部分患者就診時(shí)已是晚期，另一方面是胃癌容易發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。已有的研究表明，LOX家族蛋白質(zhì)各成員調(diào)控胃癌發(fā)生、發(fā)展的各種重要過(guò)程，主要發(fā)揮促癌作用。這為開(kāi)發(fā)LOX家族蛋白質(zhì)成員的特異性抑制劑用于治療胃癌提供了可能。值得一提的是，為了充分闡明和理解LOX家族蛋白質(zhì)在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用，仍然需要解決多個(gè)問(wèn)題。目前，大部分的研究解析了LOX家族蛋白質(zhì)的下游靶點(diǎn)，但LOX家族蛋白質(zhì)成員如何被上游基因調(diào)控以及如何發(fā)生蛋白質(zhì)降解尚不清楚。為了更深入地確定LOX家族蛋白質(zhì)成員的功能，應(yīng)建立基因敲入和基因敲除等工程小鼠模型。此外，還需要對(duì)抑制LOX家族蛋白質(zhì)的小分子抑制劑進(jìn)行高通量篩選，以發(fā)現(xiàn)可用于胃癌治療的LOX家族蛋白質(zhì)成員的特異性抑制劑。