葡萄籽原花青素對多浪羊精液常溫保存效果的研究

郝 文，晏 航，吳啟輝，王惠娥,2*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

近年來，人工授精技術(shù)在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。由于綿羊精子自身結(jié)構(gòu)的原因，低溫、冷凍保存可能會影響綿羊精子獲能、代謝及精子頂體蛋白酶活性等，同時，綿羊子宮頸形態(tài)特征的特殊性以及凍精輸精條件等在野外的不可行[1-2]使得綿羊精液常溫保存?zhèn)涫苄竽凉ぷ髡叩南矏邸?/p>

精液在處理和保存過程中會進(jìn)行代謝，由于體內(nèi)外環(huán)境的改變，精子作為一個需氧系統(tǒng)會產(chǎn)生活性氧（ROS），適量的ROS 對調(diào)節(jié)精子正常生理功能、結(jié)合透明帶能力的提升等是必要的[3]。過多的ROS 會損害精子質(zhì)膜和頂體，甚至?xí)?dǎo)致精子DNA 受損，進(jìn)而影響精子在體外的存活時間和受精能力[4]。葡萄籽原花青素（GSPs）是一種生物類黃酮，具有超強(qiáng)的抗氧化劑活性，具有清除自由基和延緩衰老的效果。李春陽等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著提取純度提高，GSPs 抗氧化和清除自由基的能力相應(yīng)提升。胡亞美等[6]研究發(fā)現(xiàn)，GSPs可延長豬精液常溫保存時間。孫艷青等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GSPs 可顯著提高豬精液冷凍解凍后精子的品質(zhì)和抗氧化能力。本實驗在多浪羊精液常溫保存稀釋液中添加不同濃度GSPs，在保存過程中檢測總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA），旨在篩選出適宜的GSPs 添加濃度，為多浪羊精液常溫保存稀釋液的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 精液來源 本實驗用精液采自塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實驗基地3 頭健康的18 月齡多浪羊。

1.1.2 試劑 葡萄籽原花青素，純度≥95%（上海源葉生物科技有限公司[2]）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）、乳糖（百瑞金生物科技有限公司）、檸檬酸（西安灞橋區(qū)化學(xué)試劑廠）、T-AOC和MDA 測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 精液稀釋液的配制 基礎(chǔ)稀釋液：稱取Tris 2.42 g，檸檬酸1.68 g，乳糖0.5 g，用電子天平準(zhǔn)確稱量后溶解于100 mL 滅菌超純水中，充分混勻，配置成基礎(chǔ)稀釋液。每100 mL 基礎(chǔ)稀釋液中分別添加0、1、3、5、7、9、12、14 mg GSPs，充分溶解后得到GSPs 質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.12、0.14 g/L的多浪羊精液稀釋液，置于4℃冰箱中保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 精液采集及處理 用電刺激法采集多浪羊公羊精液，裝入37℃保溫桶，快速帶回實驗室。選取采精量大于0.5 mL，色澤和氣味正常的精液，在400×顯微鏡下對精液樣品進(jìn)行觀察，選擇精子活力在0.8 以上的精液用于后續(xù)試驗。將3 份合格的精液混勻，使用2.5 mL離心管每管分裝200 μL 精液，后將精液按照二次稀釋法進(jìn)行等溫稀釋，即先加入1 mL 不同濃度的GSPs 稀釋液，平衡10 min 后再添加剩余體積的稀釋液（總稀釋比為1:10）。測定稀釋后精液的活力，活力達(dá)到0.7以上的置于18℃恒溫箱中保存，為防止精液發(fā)生沉淀和發(fā)生精子凝集現(xiàn)象，每隔8 h 翻動離心管1 次。

1.2.2 精子活率和活力的檢測 精子活力評定采用主觀評定法進(jìn)行測定，分10 級制表示。即按精子直線運動占視野中精子的估計百分比來表示（如：100%前進(jìn)者為1.0，90% 即為0.9，以此類推）。每隔24 h 從離心管中吸取20 μL 精液，用預(yù)熱的18℃的0.9%生理鹽水再次稀釋5 倍，置于37℃水浴鍋孵育2 min 后，然后吸取10 μL 精液滴于37℃預(yù)熱的載玻片上，于400×光學(xué)顯微鏡下對精子進(jìn)行觀察，運動精子占總精子數(shù)的比例即為精子的活力[8]。精子死亡率評定采用苯胺黑-伊紅雙染的方法[9]，活率=（總精子數(shù)-染紅色精子數(shù)）/總精子數(shù)。

1.2.3 精子頂體完整率、質(zhì)膜破損率和畸形率檢測 采用吉姆薩染色法進(jìn)行畸形率檢測[10]；采用精子尾部低滲試驗進(jìn)行質(zhì)膜完整率檢測；利用花生凝集素?zé)晒馊旧z測精子頂體完整性[6]。

1.2.4 精子生理參數(shù)檢測 精液中T-AOC 和MDA 指標(biāo)測定按照南京建成公司提供的試劑盒檢測，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行方差分析（One-way ANOVA）、LSD 和Duncan's多重比較，分析組間差異顯著性。每個處理重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GSPs 對多浪羊精子活率的影響 由表1可知，在常溫保存下多浪羊精子活率隨著GSPs 添加濃度的增大，呈現(xiàn)逐漸遞增后遞減的趨勢。在保存24 h內(nèi)各組間差異不顯著；保存48～240 h，添加濃度為0.09、0.12 和0.14 g/L 組的精子活率較其他添加組和對照組均顯著提高；168～ 240 h，GSPs 添加質(zhì)量濃度為0.09 g/L組精子活率差異顯著于其他各組，0.01 g/L 和0.03 g/L組間無差異，0.05 g/L 和0.07 g/L 組間無差異，0.12 g/L和0.14 g/L 組間無差異，但相對于對照組精子活率均不同程度的提高。

表1 常溫保存（18℃）下不同質(zhì)量濃度GSPs 對多浪羊精子活率的影響 %

2.2 不同濃度GSPs 對多浪羊精子活力的影響 由表2 可知，常溫保存24～168 h，與對照組相比，添加GSPs 組的精子活力均提高，隨著添加濃度的增加，呈先遞增后遞減的趨勢。不同處理組的保存時間不同（以精子活力保持在60%以上計算），0.09 g/L GSPs 組維持時間為144 h，0.12、0.14 g/L GSPs 組為120 h，0.03、0.05 g/L GSPs 組為96 h，對照組和0.01 g/L GSPs 組為72 h，說明添加GSPs 可延長精子保存時間。保存時間在24～96 h，0.09、0.12 g/L GSPs 組多浪羊精子活力高于其他添加組和對照組（P＜0.05）；保存時間192～ 240 h，對照組和0.01、0.03 g/L GSPs 組的精子活力差異不顯著。

表2 常溫保存（18℃）下不同質(zhì)量濃度GSPs 對多浪羊精子活力的影響 %

2.3 不同濃度GSPs 對多浪羊精子畸形率的影響 由表3 可知，多浪羊精子常溫保存時間24 h，除0.01 g/L GSPs 組外，其他添加組精子畸形率顯著低于對照組；常溫保存時間120 h，0.09 g/L GSPs 組精子畸形率相對較低，保持在20%以內(nèi)。

表3 常溫保存（18℃）下不同濃度GSPs 對多浪羊精子畸形率的影響 %

2.4 不同濃度GSPs 對多浪羊精子質(zhì)膜破損率的影響由表4 可知，多浪羊精子在常溫保存下添加GSPs 對精子質(zhì)膜有明顯保護(hù)作用，隨著GSPs 質(zhì)量濃度增大，各試驗組多浪羊精子質(zhì)膜破損率呈先遞減后遞增的趨勢。當(dāng)保存120 h 時，0.09 g/L GSPs 組的精子質(zhì)膜破損率最?。≒＜0.05），為30.75%。

表4 常溫保存（18℃）下不同濃度GSPs 對多浪羊精子質(zhì)膜破損率的影響 %

2.5 不同濃度GSPs 對多浪羊精子頂體完整性的影響由表5 可知，常溫保存24 h，添加GSPs 對多浪羊精子頂體完整性試驗組與對照組比較差異不顯著，但在常溫保存48～120 h，各試驗組與對照組的精子頂體完整性差異明顯，GSPs 質(zhì)量濃度為0.09 g/L 多浪羊精子頂體完整性為67.4%，顯著高于其他各試驗組和對照組（P＜0.05）。

表5 常溫保存（18℃）下不同濃度GSPs 對多浪羊精子頂體完整性的影響 %

2.6 不同濃度GSPs 對多浪羊精液T-AOC 及MDA 活性的影響 由表6 可知，隨著GSPs 質(zhì)量濃度的增加，常溫保存多浪羊精液中T-AOC 活性先增后減的趨勢，而多浪羊精液中MDA 含量與T-AOC 的變化趨勢相反；隨著保存時間的延長，添加GSPs 組T-AOC 呈下降趨勢，而MDA 呈上升趨勢。在保存120 h 時，0.09、0.12 g/L GSPs 組T-AOC 活性為2.12、2.11 U/mL，顯著高于其他組，而MDA 為1.90、1.92 nmol/mL，顯著低于其他組。

表6 不同質(zhì)量濃度GSPs 對常溫保存（18℃）多浪羊精液中T-AOC 活性和MDA 含量的影響 %

3 討 論

GSPs 是葡萄多酚類化合物的重要組成部分，其抗氧化和自由基清除能力可能與所處的溶劑環(huán)境有關(guān)[11]。孫蕓等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水相體系中的原花青素分子中單位酚羥基的活性隨著聚合度的增加而下降。當(dāng)多浪羊精液稀釋液在18℃恒溫條件下保存時，精子的耗能和代謝活動仍在緩慢發(fā)生，并且隨著保存時間的逐漸增長活性氧自由基含量也不斷增加，其一旦過量則會發(fā)生氧化應(yīng)激，從而損傷精子細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，加速精子死亡[13]。同時，活性氧（ROS）也會攻擊頂體膜，使頂體酶提前釋放而不能進(jìn)行頂體反應(yīng)，降低受精率，嚴(yán)重影響精子保存質(zhì)量[14-16]。生物膜中脂質(zhì)部分包含大量不飽和脂肪酸，ROS 攻擊不飽和脂肪酸，促進(jìn)氧化或過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，并降解成MDA[14-16]。

3.1 不同濃度GSPs 對精液的影響 李方舟等[17]在山羊精液低溫保存中添加葡萄籽花青素的濃度為30 mg/L 最佳。張柳明等[18]發(fā)現(xiàn)，在湖羊精液常溫保存基礎(chǔ)稀釋液中添加花青素0.01 g/L 對精液的保存效果較好。相關(guān)研究資料表明，添加抗氧化劑均能改善羊精液品質(zhì)，提高繁殖效率[2,19-20]。但是在上述研究中所需添加GSPs濃度各有不同，第一，基礎(chǔ)稀釋液成分不同，孫蕓等[12]研究發(fā)現(xiàn)，原花青素的抗氧化和自由基清除能力可能與所處的溶劑環(huán)境有關(guān)。本試驗中，精液稀釋液主要為Tris+檸檬酸+果糖組合，張柳明等[18]所用基礎(chǔ)稀釋液為Tris+檸檬酸+果糖組合，李方舟等[17]所用基礎(chǔ)稀釋液為葡萄糖+D-果糖+PVA+EDTA+檸檬酸鈉+碳酸氫鈉+青霉素+鏈霉素+卵黃；第二，研究對象及品種不同，不同品種羊精液性狀的遺傳參數(shù)和精清中低分子量成分不同，因此導(dǎo)致最適添加量有差異和保存時間的差異。Fang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精清中含有鋅、酸性磷酸酶或果糖、葡萄糖苷酶等物質(zhì)。Fraser 等[22]發(fā)現(xiàn)，去除豬精清中的低分子組分對提高豬精子解凍后的精子質(zhì)量是有效的，對改進(jìn)精子常溫保存方案也具有重要的現(xiàn)實意義。Pelayo 等[23]發(fā)現(xiàn)綿羊精液性狀遺傳參數(shù)與動物自身所處環(huán)境、管理、遺傳因素和生理狀況均有關(guān)。

3.2 精液品質(zhì)提高的原因 有研究GSPs 可以通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性等途徑提高動物機(jī)體的抗氧化能力[11]。牟春堂等[24]發(fā)現(xiàn)，GSPs 可提高綿羊睪丸和附睪組織抗氧化能力，改善精液品質(zhì)。孫艷青等[7]發(fā)現(xiàn)，GSPs 可有效降低MDA 含量，能有效提高豬精液冷凍保存后精子品質(zhì)和抗氧化能力。

本實驗結(jié)果顯示，精子T-AOC 隨GSPs 添加濃度升高而先遞增后遞減，MDA 含量隨著添加質(zhì)量升高而先降低后升高，這與胡亞美等[6]在豬精液常溫保存中所得結(jié)果類似。脂質(zhì)過氧化物代謝產(chǎn)生MDA 類有害物質(zhì)越多，精子抗氧化能力越低，受損越嚴(yán)重。細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性提高可有效抑制過量ROS 的產(chǎn)生，從而降低細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷，提高精液品質(zhì)。綜合分析其原因一方面添加GSPs 天然抗氧化劑到稀釋液中，其結(jié)構(gòu)中的酚性羥基能在液體環(huán)境中產(chǎn)生H+，H+作為無電子不穩(wěn)定的離子，會搶奪自由基上的電子以達(dá)到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而使自由基失活，降低精子線粒體膜和脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保證了精子功能發(fā)揮的完整性[16]；另一方面，在本實驗中，添加GSPs 會使精子T-AOC活性增強(qiáng)，且添加量為0.09 g/L 時活性最高，在保存120 h 時可達(dá)2.12 U/mL。也可能是由于添加GSPs 激活了精液中抗氧化酶的活性[4]，從而增強(qiáng)了精子T-AOC活性來保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激的損傷。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，在常溫保存基礎(chǔ)精液稀釋液Tris+檸檬酸+果糖中添加GSPs 對多浪羊精液具有保護(hù)作用，可延長保存時間，同時可提高T-AOC 濃度降低MDA 含量，其最適添加濃度為0.09 g/L。