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    鴨坦布蘇病毒感染對occludin和claudin-1基因mRNA表達(dá)的影響

    2022-11-17 05:59:28逯璐蘇興海馬世寶張琳
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:定量引物熒光

    逯璐,蘇興海,馬世寶,張琳

    (1.山東管理學(xué)院新興業(yè)態(tài)發(fā)展研究所,山東 濟(jì)南 250357;2.招遠(yuǎn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山東 招遠(yuǎn) 265400;3.德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,山東 德州 253599;4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100)

    鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是引起蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降、肉鴨和育成鴨死亡的主要病原之一,給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。以該病毒為病原的鴨坦布蘇病毒病于2010年流行于我國東南沿海,近年來已成為水禽養(yǎng)殖業(yè)常見且頻繁流行的疫病之一,也是必須監(jiān)測和防控的疫病之一[3]。目前對于該病的預(yù)防主要依靠商品化疫苗,但疫病仍頻繁出現(xiàn),且呈地方性流行趨勢,表明DTMUV已在不同區(qū)域定殖并在不同選擇壓力下突變產(chǎn)生地方流行株[4]。鑒于病毒突變的加速和相應(yīng)疫苗研發(fā)的滯后,對DTMUV的感染與致病機(jī)制進(jìn)行深入研究,從中挖掘更為有效的抗病毒策略成為該病毒的研究重點(diǎn)。

    緊密連接(tight junctions,TJ)是一種膜內(nèi)多蛋白復(fù)合體,廣泛存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間,是封閉細(xì)胞間隙維持上皮屏障功能、調(diào)控細(xì)胞通透性控制內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)出的重要成分[5,6]。緊密連接蛋白主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens,ZOs)和連接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs)組成,它們與細(xì)胞骨架蛋白將相鄰細(xì)胞連接起來構(gòu)成上皮屏障,以阻擋病原微生物的入侵,維持生理環(huán)境的穩(wěn)定[7]。但TJ蛋白也能夠被病毒“劫持”,成為感染細(xì)胞的“利器”。已有多篇報(bào)道顯示,病毒能夠使用TJ蛋白作為細(xì)胞受體感染靶細(xì)胞:occludin、claudin-1是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)入 侵 細(xì) 胞 的 共 受體[8,9],而claudin-6和claudin-9不僅是該病毒的共受體,而且能夠介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的傳播[10,11]。claudin-1是登革熱病毒(Dengue virus,DENV)進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵分子[12];occludin是西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)突破血腦屏障引起神經(jīng)癥狀的關(guān)鍵蛋白[13]。此外,claudin家族蛋白還是日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)[14]、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)[15,16]等病毒感染與擴(kuò)散的重要分子。

    DTMUV所在的黃病毒屬病毒具有高度相似的結(jié)構(gòu)組成,入侵細(xì)胞也采用類似的策略[17,18],但功能性受體至今未能明確。HCV為黃病毒科丙肝病毒屬病毒,其細(xì)胞受體已明確,而與DTMUV進(jìn)化關(guān)系最為密切的DENV、WNV、JEV同為黃病毒屬病毒,但功能性受體始終未能鑒定出來。occludin或claudin-1在上述病毒侵入細(xì)胞與擴(kuò)散環(huán)節(jié)均起到了重要作用,但在DTMUV感染細(xì)胞過程中扮演怎樣的角色尚不清楚。本試驗(yàn)利用DTMUV感染非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞,采用熒光定量方法對occludin和claudin-1基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測和比較,以有助于明確兩蛋白分子在介導(dǎo)DTMUV入侵細(xì)胞中的作用,為后續(xù)功能受體的篩選、入侵機(jī)制以及抗病毒制劑的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑

    DTMUV(TCID50為10-6.5/0.1 mL)由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存,非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。微量總RNA(病毒/細(xì)胞)提取試劑盒購自北京百邁客生物科技有限公司。One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)開展時(shí)間為2021年6—12月。分別設(shè)置試驗(yàn)組和對照組,每組5瓶(25 cm2方瓶)細(xì)胞,置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待24 h細(xì)胞長成單層后,試驗(yàn)組加入100TCID50的病毒液1 mL,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h,期間每30 min輕晃混勻一次,對照組以營養(yǎng)液替代病毒液進(jìn)行相同操作。棄去細(xì)胞瓶中的液體,并用預(yù)冷的PBS輕輕洗2次,去除未吸附病毒。隨后在每個(gè)細(xì)胞瓶中加入9 mL含2%血清的MEM培養(yǎng)基,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),分別于12、24、48、72 h收集試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞及其上清,進(jìn)行病毒載量和緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的熒光定量檢測。

    1.2.2 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 病毒載量的測定采用絕對熒光定量PCR方法,緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的檢測使用相對定量的方式?;驍U(kuò)增引物經(jīng)oligo 6.0設(shè)計(jì),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列見表1。

    表1 熒光定量PCR引物

    1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 采用微量總RNA(病毒/細(xì)胞)提取試劑盒分別提取細(xì)胞與培養(yǎng)液上清總RNA,RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ消化后,使用隨機(jī)引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA鏈的合成。RNA與cDNA產(chǎn)物置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 熒光定量PCR 測定DTMUV含量的絕對熒光定量PCR體系參照李海燕等[19]的方法。occludin、claudin-1和β-actin的引物首先進(jìn)行特異性和有效性驗(yàn)證,表達(dá)量的檢測反應(yīng)總體系(20 μL):2×SYBRPremix Ex TaqⅡ10 μL,cDNA模板1 μL,上下游引物各1 μL(10 μmol/L),雙蒸水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件:95℃1 min;95℃15 s,63℃25 s,72℃30 s,共40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)收集熒光信號;95℃5 s,60℃1 min,進(jìn)行溶解曲線分析。所有樣品的檢測均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為了證實(shí)擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性,將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T,并進(jìn)行測序。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    所有基因檢測均重復(fù)3次,取平均值。病毒含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得,兩緊密連接基因相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算,β-actin為內(nèi)參,結(jié)果以變化倍數(shù)進(jìn)行表示。應(yīng)用GraphPad Prism 5的student’st-test分析原始數(shù)據(jù),并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 occludin和claudin-1熒光定量引物的驗(yàn)證

    利用反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行新設(shè)計(jì)熒光定量引物的驗(yàn)證。結(jié)果如圖1所示,引物可以有效擴(kuò)增目的基因,溶解曲線單一,表明引物的有效性和特異性良好,可以滿足定量檢測occludin、claudin-1和β-actinmRNA的要求。同時(shí),回收擴(kuò)增片段經(jīng)測序和比對證實(shí)了片段的準(zhǔn)確性。

    圖1 occludin(A)、claudin-1(B)和β-actin(C)熒光定量PCR的擴(kuò)增及溶解曲線

    2.2 vero細(xì)胞中的病毒含量

    以100TCID50的DTMUV感染vero細(xì)胞,60 h左右細(xì)胞開始出現(xiàn)病變,而對照細(xì)胞正常。對感染后細(xì)胞上清中的病毒含量進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)病毒可在細(xì)胞中有效復(fù)制,并在48 h達(dá)到峰值,之后開始緩慢下降,而對照組始終未檢測到病毒(圖2)。

    圖2 細(xì)胞中的病毒含量

    2.3 occludin基因的表達(dá)量

    與對照組相比,occludin基因的表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào),12 h為表達(dá)峰值,而后逐漸降低,72 h僅為對照組的59%(圖3)。

    圖3 occludin基因的表達(dá)量

    2.4 claudin-1基因的表達(dá)量

    與對照組相比,claudin-1基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖4)。在感染前期,claudin-1claudin-1的表達(dá)量上調(diào),至24 h達(dá)到峰值,而后開始下降,至72 h表達(dá)量下調(diào),為對照組的76%。

    圖4 claudin-1基因的表達(dá)量

    3 討論與結(jié)論

    病毒侵入宿主細(xì)胞是整個(gè)復(fù)制周期的首要環(huán)節(jié),而受體是介導(dǎo)病毒吸附、內(nèi)吞以及膜融合等侵入過程的關(guān)鍵宿主因子[20,21],它決定了易感宿主的范圍、組織嗜性和致病性。所以,對受體的研究成為了解病毒入侵機(jī)制以及開發(fā)抗病毒制劑的突破口。

    DTMUV具有較為廣泛的宿主范圍,除了感染鴨、鵝等水禽和雞、麻雀等其他禽類外[22,23],也可以感染哺乳動(dòng)物[24],亦有感染人類的報(bào)道,但并不表現(xiàn)出致病性[25]。病毒還具有廣泛的組織嗜性,除肝臟、脾臟、心臟等多臟器會(huì)發(fā)生較為明顯的病變外,還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)病癥和典型的神經(jīng)癥狀[26,27]。在病毒的體外培養(yǎng)時(shí),DTMUV在多種來源的細(xì)胞和禽胚均可增殖[28]。這些現(xiàn)象表明,DTMUV的細(xì)胞受體應(yīng)該是多物種、多組織器官普遍存在且功能高度保守的蛋白分子。

    前期通過細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組的測定,發(fā)現(xiàn)了多種在DTMUV感染后表達(dá)量發(fā)生明顯變化的蛋白分子(結(jié)果另文發(fā)表),occludin、claudin-1就是其中的兩個(gè)。兩者是緊密連接蛋白重要的組成部分,廣泛分布于各組織中,但含量存在差異,在免疫細(xì)胞豐富的組織中含量較少,而在免疫細(xì)胞較少的組織中含量較高,體現(xiàn)了它們在組織防御功能中的補(bǔ)償作用[6]。特別要指出的是,在正常情況下,緊密連接蛋白還是構(gòu)成血腦屏障的重要組分[29]。DTMUV感染病例多有神經(jīng)癥狀,病毒是如何突破血腦屏障的,一直未見報(bào)道。相關(guān)研究表明,在腦病發(fā)生時(shí),occludin的表達(dá)量會(huì)發(fā)生顯著變化,已成為診斷腦病的重要生物指標(biāo)[29]。occludin是否也被DTMUV作為細(xì)胞受體利用或者起到利于傳播的作用以突破血腦屏障,在后續(xù)研究中需要進(jìn)行深入探討。

    DENV-2感染人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞后會(huì)激活整合素β3的上調(diào)表達(dá),從而利于病毒的入胞[30];感染的小腸上皮細(xì)胞和vero細(xì)胞中,隨著PEDV的復(fù)制,occludinmRNA的表達(dá)量顯著上調(diào),兩者的結(jié)合及內(nèi)化是病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵[31],類似的結(jié)果也出現(xiàn)在PRRSV與感染細(xì)胞(Mark145)的claudin-4相互作用中[32]。在本試驗(yàn)中,DTMUV感染后的12~48 h,病毒含量明顯上升,而occludin和claudin-1也均為上調(diào)表達(dá),表明病毒的感染激活了兩個(gè)基因的表達(dá),提示在病毒感染細(xì)胞的過程中可能以受體或關(guān)鍵因子的身份參與了病毒入侵細(xì)胞的過程。而隨著病毒的進(jìn)一步增殖,72 h細(xì)胞已出現(xiàn)明顯病變,occludin和claudin-1mRNA的表達(dá)量變?yōu)橄抡{(diào)表達(dá),這應(yīng)該與細(xì)胞發(fā)生損傷導(dǎo)致通透性改變以及隨病毒內(nèi)化的緊密連接蛋白被降解有關(guān)。至于兩分子與病毒粒子的結(jié)合機(jī)制及其在感染中的作用也是我們下一步的研究重點(diǎn)。

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