基于生物信息學(xué)分析S100P基因在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

許 康，白 麗，2*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的GLOBOCAN 2020統(tǒng)計，乳腺癌已超越肺癌成為全球第一大癌癥（占比11.7%）〔1〕。在乳腺癌的治療方法上，目前主要是手術(shù)治療結(jié)合化療，但對于轉(zhuǎn)移性乳腺癌來說仍需其他治療手段改善患者生存率，新的治療方法包括信號通路抑制劑、節(jié)律化療、抗體-藥物結(jié)合系統(tǒng)、納米顆粒等的研究都還處于起步階段〔2-3〕。乳腺癌重要的預(yù)后標(biāo)志物主要是腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、腫瘤大小和腫瘤分級，但這些標(biāo)志物不足以對現(xiàn)今提倡個性化治療的乳腺癌患者進(jìn)行有針對性的治療，特別是對于早期乳腺癌患者〔3〕。因此，篩選影響乳腺癌疾病進(jìn)展及預(yù)后的標(biāo)記分子對乳腺癌患者治療的多樣性和改善預(yù)后有重要臨床意義。S100鈣結(jié)合蛋白P（S100 calcium binding protein P，S100P）是S100鈣結(jié)合蛋白家族成員之一，除在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用外，還參與癌癥的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移〔4〕。在乳腺癌早期通常有S100P的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的Fos相關(guān)抗原2（Fosrelated antigen 2，F(xiàn)ra-2）可上調(diào)S100P的表達(dá)，并增加乳腺癌的侵襲性〔5〕。乳腺癌分為原位癌（非浸潤癌）和浸潤癌，因原位癌易于治療、預(yù)后好，不是乳腺癌研究的重點(diǎn)，且各數(shù)據(jù)庫只收錄浸潤癌相關(guān)數(shù)據(jù)，故本研究通過生物信息學(xué)方法分析S100P在乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma，BRCA）中的表達(dá)及其共表達(dá)基因的生物學(xué)功能，探討S100P基因作為預(yù)后判斷的價值，為以S100P基因?yàn)榘悬c(diǎn)的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源本研究數(shù)據(jù)來源于GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）、UALCAN數(shù) 據(jù) 庫（http：//ualcan.path.uab.edu）、KM Plotter數(shù) 據(jù) 庫（https：//kmplot.com/analysis/）、LinkedOmics數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.linkedomics.org）和STRING數(shù) 據(jù) 庫（https：//cn.string-db.org/）。

1.2 數(shù)據(jù)獲取

1.2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫GEPIA數(shù)據(jù)庫基于TCGA和GTEX的9 736個腫瘤樣本和8 587個正常樣本，可進(jìn)行泛癌分析、差異表達(dá)分析、相關(guān)性分析、患者生存分析等〔6〕。該數(shù)據(jù)庫在本研究中用于挖掘S100P基因的泛癌表達(dá)以及分析在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)差異。泛癌分析篩選條件為：“概述”“基因：S100P”“數(shù)據(jù)集：全部”。S100P基因在BRCA與正常組織表達(dá)差異篩選條件為“箱式圖”“基因：S100P”“數(shù)據(jù)集：BRCA”。

1.2.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫UALCAN數(shù)據(jù)庫基于TCGA 31種癌癥類型的RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，可進(jìn)行TCGA數(shù)據(jù)深度分析〔7〕。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析S100P與BRCA淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的關(guān)系。“輸入基因名稱：S100P”“TCGA數(shù)據(jù)集：BRCA”“分析鏈接：表達(dá)”。

1.2.3 KM Plotter數(shù)據(jù)庫KM Plotter數(shù)據(jù)庫能夠使用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)或代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量和多變量COX回歸分析，并繪制KM生存曲線〔8〕。利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫評估S100P在乳腺癌中的預(yù)后價值。篩選條件為：“乳腺癌”“開始乳腺癌KM繪圖”“輸入基因名稱：S100P”“患者分組依據(jù)：自動選擇最佳值”“生存率：依次選擇無復(fù)發(fā)生存（relapse free survive，RFS）、總生存時間（overallsurvival，OS）、遠(yuǎn)端無轉(zhuǎn)移生存（distalmetastasisfree survival，DMFS）、進(jìn)展后生存（post-progression survival，PPS）”“繪制Kaplan-Meier曲線”。

1.2.4 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫LinkedOmics數(shù)據(jù)庫包含TCGA和臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)會的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，是第一個多組學(xué)數(shù)據(jù)庫〔9〕。通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析S100P相關(guān)性基因，并進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋與富集分析。相關(guān)性分析：“選擇癌癥類型：BRCA”“選擇檢索數(shù)據(jù)集：根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq”“選擇檢索數(shù)據(jù)集屬性：S100P”“選擇目標(biāo)數(shù)據(jù)集：根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇RNAseq”“選擇統(tǒng)計方法：皮爾遜相關(guān)檢驗(yàn)”。GO和KEGG富集分析：“鏈接釋義：基因集富集分析（GSEA）”“富集分析：依次選擇生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能、KEGG通路”。

1.2.5 STRING數(shù)據(jù)庫STRING數(shù)據(jù)庫可整合蛋白質(zhì)之間物理相互作用和功能上的關(guān)聯(lián)，創(chuàng)建清晰明了的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)〔10〕。利用STRING數(shù)據(jù)庫分析S100P與其他蛋白質(zhì)的相互作用。“蛋白名稱：S100P”“物種：智人”。

1.3 統(tǒng)計方法采用數(shù)據(jù)庫默認(rèn)統(tǒng)計方法。S100P泛癌分析以及在癌組織和正常組織差異表達(dá)分析采用單因素方差分析；皮爾遜相關(guān)法分析基因表達(dá)相關(guān)性；生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100P基因在常見腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了S100P基因在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，S100P基因在14種腫瘤中存在差異表達(dá)。其中，在BRCA、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌、結(jié)腸腺癌、肝細(xì)胞肝癌、肺腺癌、胰腺癌、直腸腺癌、子宮體子宮內(nèi)膜癌、子宮癌肉瘤中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、前列腺癌、皮膚黑色素瘤、甲狀腺癌、胸腺癌中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

2.2 S100P基因在BRCA組織和正常乳腺組織中的表達(dá)差異對GEPIA數(shù)據(jù)庫中1 085例BRCA組織和291例正常乳腺組織S100P在mRNA水平的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果表明，S100P基因在BRCA組織中的表達(dá)高于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.3 S100P表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期相關(guān)性S100P的表達(dá)水平在BRCA不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期中存在差異，在N0、N1、N2、N3分期中的表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且N0與N1，N1與N2，N2與N3之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.4 S100P在乳腺癌預(yù)后判斷中的價值采用KM Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析S100P在乳腺癌預(yù)后判斷中的價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100P低表達(dá)組OS為120.00月，明顯高于S100P高表達(dá)組的59.15月（P<0.001）。見圖3A。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，S100P低表達(dá)組RFS、DMFS、PPS均高于S100P高表達(dá)組（P<0.001）。見圖3B~D。

2.5 S100P共表達(dá)基因及GO功能富集分析、KEGG信號通路分析用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析得到與S100P表達(dá)相關(guān)基因共6 485個，其中，正相關(guān)基因3 207個，負(fù)相關(guān)基因3 278個。（P<0.05，F(xiàn)DR<0.01）。與S100P正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的前10個主要基因見表1。通過生物學(xué)過程富集分析發(fā)現(xiàn)，S100P共表達(dá)基因主要參與粒細(xì)胞活化、線粒體基因表達(dá)、糖基化、白細(xì)胞遷移、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、表皮發(fā)育、形成細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織等生物學(xué)過程，而形成纖毛組織、染色質(zhì)共價修飾等活動受抑制。見表2。細(xì)胞成分富集分析顯示，S100P共表達(dá)基因主要與囊泡腔、線粒體內(nèi)膜、分泌顆粒膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等細(xì)胞成分有關(guān)，而在睫狀部、突觸膜等成分低表達(dá)。見表3。分子功能富集分析表明，與S100P共表達(dá)基因相關(guān)的分子功能包括電子轉(zhuǎn)移活性、作用于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化還原酶活性、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性等，但組蛋白結(jié)合活性受抑制。見表4。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)S100P共表達(dá)基因主要參與蛋白酶體、溶酶體、代謝通路、白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）信號通路以及一些自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的相關(guān)信號通路的調(diào)控。見表5。

表1 S100P前10個共表達(dá)正、負(fù)相關(guān)基因

表2 S100P共表達(dá)基因的生物學(xué)過程富集分析結(jié)果

表3 S100P共表達(dá)基因的細(xì)胞成分富集分析結(jié)果

表4 S100P共表達(dá)基因的分子功能富集分析結(jié)果

表5 S100P共表達(dá)基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果

2.6 S100P相互作用蛋白分析使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建S100P相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示共19個蛋白與S100P相關(guān)，平均聚類系數(shù)為0.831（P<0.001），相互作用的蛋白分別是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，AGER）、鈣周期素結(jié)合蛋白（calcyclin-binding protein，CACYBP）、戴 帽 蛋 白α1（capping actin protein of muscle z-line alpha subunit 1，CAPZA1）、絨毛蛋白/埃茲蛋白（villin 2/ezrin，EZR）、含F(xiàn)XYD結(jié)構(gòu)域的離子通道調(diào)節(jié)蛋白3（FXYD domaincontaining ion transport regulator 3，F(xiàn)XYD3）、白細(xì)胞介素11（interleukin-11，IL-11）、含IQ基序的GTP酶激活蛋白1（IQ motif containing GTPase activating protein 1，IQGAP1）、肌球蛋白重鏈9（myosin heavy chain 9，MYH9）、核仁和紡錘體相關(guān)蛋白1（nucleolar and spindle-associated protein 1，NUSAP1）、鳥 氨 酸 脫 羧 酶 抗 酶1（ornithine decarboxylase antizyme 1，OAZ1）、核糖體蛋白S9（ribosomal protein S9，RPS9）、S100鈣結(jié)合蛋白A1（S100 calcium binding protein A1，S100A1）、S100鈣結(jié) 合 蛋 白B（S100 calcium binding protein B，S100B）、S100P結(jié)合蛋白（S100P binding protein，S100PBP）、S100鈣 結(jié) 合 蛋 白Z（S100 calcium binding protein Z，S100Z）、二 胺 乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶1（diamine acetyltransferase 1，SAT1）、小核核糖核蛋白F（small nuclear ribonucleoprotein F，SNRPF）、MIS12著絲粒合成裝配分子伴侶（SGT1 homolog，MIS12 kinetochore complex assembly cochaperone，SUGT1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）。

3 討論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，惡性程度高，且發(fā)病率逐年增高，年輕女性患三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的風(fēng)險逐年增加〔11〕。乳腺癌預(yù)后普遍較差，惡性程度最高的TNBC患者OS為1年，而其他亞型的乳腺癌晚期患者OS約為5年〔2〕。近年來，許多研究致力于尋找和驗(yàn)證乳腺癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物，成功應(yīng)用于臨床的包括Oncotype DX、MammaPrint和uPA/PAI-1等多基因檢測，但存在價格昂貴、缺乏長期隨訪驗(yàn)證等問題〔3〕。因此探尋新的標(biāo)志物，建立簡單廉價的檢測方法是乳腺癌預(yù)后監(jiān)測的一個重要目標(biāo)。

S100P是S100蛋白家族成員，是由95個氨基酸構(gòu)成的二聚體蛋白，氨基端和羧基端的EF-Hand結(jié)構(gòu)域?yàn)镃a2+結(jié)合位點(diǎn)，已被證實(shí)在多種腫瘤中表達(dá)〔5〕。研究〔12〕表明，胰腺癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子促進(jìn)S100P在瘤周淋巴管中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（lymphatic endothelial cells，LECs）的表達(dá)，通過S100P/RAGE信號通路促進(jìn)LECs的遷移和環(huán)狀化學(xué)排斥劑誘導(dǎo)的缺陷（circular chemorepellentinduced defects，CCID），其中CCID是球形癌細(xì)胞在LECs單層中形成的大的無細(xì)胞區(qū)域，結(jié)果說明S100P與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另一項(xiàng)研究〔13〕發(fā)現(xiàn)，S100P參與E-鈣黏蛋白在胃癌中的黏附和腫瘤抑制功能，促進(jìn)E-鈣黏蛋白陰性的胃癌細(xì)胞存活，增強(qiáng)其侵襲能力，導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展。

本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析S100P基因在常見腫瘤組織與正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示S100P基因在多種腫瘤中差異表達(dá)，這與當(dāng)前S100P基因在各種腫瘤中的研究結(jié)果相同，表明S100P基因在腫瘤中差異表達(dá)的現(xiàn)象較普遍。進(jìn)一步分析乳腺癌中S100P mRNA水平的表達(dá)差異，腫瘤組織明顯高于正常組織。為了驗(yàn)證這種差異表達(dá)是否與疾病進(jìn)展有關(guān)聯(lián)，本研究利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析S100P基因與不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)N0與N1，N1與N2，N2與N3之間表達(dá)存在差異，提示S100P基因可能與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在乳腺癌血清S100P的研究〔14〕中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血清S100P水平升高，這與本研究結(jié)果一致。為了探討S100P在乳腺癌中的預(yù)后價值，本研究采用KM Plotter在線繪圖工具進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100P低表達(dá)組OS、RFS、DMFS、PPS均明顯高于S100P高表達(dá)組，提示S100P在乳腺癌中的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。

為了進(jìn)一步探究S100P參與的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析S100P共表達(dá)基因及GO功能富集分析、KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)與S100P表達(dá)正相關(guān)基因有3 207個，負(fù)相關(guān)基因有3 278個。GO功能富集分析結(jié)果顯示S100P主要表達(dá)于線粒體內(nèi)膜、囊泡腔等結(jié)構(gòu)，主要參與糖基化、線粒體基因表達(dá)、粒細(xì)胞活化等生物學(xué)活動，并調(diào)節(jié)一些酶的活性。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)S100P主要參與蛋白酶體、IL-17信號通路、溶酶體等信號通路以及一些自身免疫病相關(guān)信號通路。蛋白酶體是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin–proteasome system，UPS）的重要組成部分，腫瘤細(xì)胞可上調(diào)UPS，對腫瘤抑制蛋白進(jìn)行降解，避免自身凋亡〔15〕。在IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，一些炎癥介質(zhì)能刺激功能失調(diào)的髓樣細(xì)胞募集，形成利于血管生成和免疫抑制的腫瘤環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，IL-17通過多種機(jī)制參與腫瘤的早期形成階段，尤其是炎癥驅(qū)動的腫瘤類型〔16〕。S100P可能是UPS和IL-17通路的潛在靶點(diǎn)。

本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫分析構(gòu)建了S100P蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)有19個蛋白與S100P存在相互作用，包括AGER、CACYBP、CAPZA1、EZR、FXYD3、IL-11、IQGAP1、MYH9、NUSAP1、OAZ1、RPS9、S100A1、S100B、S100PBP、S100Z、SAT1、SNRPF、SUGT1、TP53。這些蛋白中絕大多數(shù)與腫瘤相關(guān)，但是否與S100P共同影響乳腺癌生物學(xué)特性，還有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

本研究基于多種生物信息學(xué)分析工具探討S100P基因在乳腺癌中的表達(dá)及意義。S100P基因在乳腺癌中高表達(dá)，與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并影響患者預(yù)后，且S100P與多種蛋白質(zhì)共同作用影響乳腺癌的生物學(xué)特性。S100P基因可能作為乳腺癌的潛在靶點(diǎn)，具有一定預(yù)后價值。