美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制備及細胞毒性研究

高 冉，張維煒，吉春燕，劉光明，郭美仙，劉曉波

（大理大學藥學院，云南 大理 671000）

在腫瘤治療中，由于抗腫瘤藥物半衰期較短、治療周期長，對正常細胞有強烈的殺傷作用，常導致治療失敗，可采用靶向制劑將藥物遞送到腫瘤部位發(fā)揮藥效〔1〕，從而提高患者的生存率。葡聚糖是一種水溶性的天然多糖，具有較好的穩(wěn)定性、低免疫原性、良好的水溶性和生物相容性等特性，常作為高分子載體遞送藥物及蛋白質〔2〕，同時借助外加磁場作用或利用細胞特異性配體作為靶向基團，將藥物遞送至腫瘤組織，達到提高腫瘤靶區(qū)內藥物濃度，減少毒副作用的效果，可用于臨床診斷、免疫檢測、腫瘤治療和靶向給藥〔3〕。前期研究〔4-7〕已證實，美洲大蠊提取物多肽具有較強的體內抗腫瘤活性，同時可改善免疫力低下小鼠的免疫功能，與化療藥物聯合治療H22荷瘤小鼠具有增效減毒作用。但蛋白多肽類藥物分子量大、脂溶性差，與消化道生物膜的親和力差，難以通過消化道的生物膜屏障，其口服生物利用度普遍較低〔8〕。本實驗將美洲大蠊提取物多肽制成粒徑≤5 μm的葡聚糖微粒，一方面可直接作為劑型存在，如干粉吸入劑，在空氣中直接、高效地進入肺泡，作用于患部；另一方面可包封于聚合物微粒，既起到靶向的作用，又達到緩釋的目的，最終減少用藥量與給藥次數，延長藥物作用時間〔9〕。葡聚糖微粒作為載藥系統時，會在體內與各種類型的細胞發(fā)生相互作用，在評價其應用前景時，檢測其可能引發(fā)的毒副作用至關重要〔10〕。本研究通過體外毒性評價方法，檢測美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對HepG2和A549兩株細胞的細胞毒性，評價美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的生物安全性，為進一步應用于干粉吸入劑或緩釋微粒等劑型提供技術支持和實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料美洲大蠊提取物多肽由大理大學何正春副教授提供；聚乙二醇（PEG）6000、葡聚糖（美國Sigma公司）；二氯甲烷（天津市福晨化學試劑廠）；MicroBCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有有限公司）；HepG2、A549細胞（中國科學院昆明動物所細胞庫）；Annexin V-EGFP、碘化丙啶（碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器ALPHA1-4LSC冷凍干燥機（德國CHRIST公司）；XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；伯騰ELX808酶標儀（美國伯騰儀器）；RTCA實時無標記細胞分析儀（美國ABI公司）；冷場發(fā)射S4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）。

2 方法

2.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制備方法及表征

2.1.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制備將美洲大蠊提取物多肽水溶液和葡聚糖溶液混勻，在0℃按一定比例將PEG6000溶液加入一起混勻攪拌1 min，形成乳液，立即置于-20℃冰箱預凍8~12 h。預凍好的樣品放入事先開啟的真空冷凍干燥機（待溫度降到-80℃）凍干24 h。用二氯甲烷洗滌凍干的粉末，并用旋渦混合器旋渦5 min使PEG6000充分溶解，16 000 r/min離心5 min，待葡聚糖顆粒全部沉淀，去上清液，重復3~5次。將除去PEG6000的樣品在通風櫥自然揮干12~24 h，制得美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒〔11〕。

2.1.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的載藥量、包封率和質量回收率測定 精密稱取10.0 mg美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，于4℃用一定量的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解。配制蛋白標準溶液：將30.0 mg牛血清白蛋白（BSA）標準品溶解于1.2 mL蛋白標準配制液中，制成濃度為25.0 mg/mL的蛋白標準液，充分溶解混勻，取適量25.0 mg/mL蛋白標準液，稀釋至終濃度為0.5 mg/mL。制作蛋白標準曲線：取0、1、2、4、8、12、16、20 μL的0.5 mg/mL蛋白標準液加入到標記好的96孔板中，每孔分別加20、19、18、16、12、8、4、0 μL的PBS使各孔體積為20 μL，形 成 終 濃 度 為0.000、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL的標準品。配制待測樣品：取各組待測樣品5 μL，加入PBS 15 μL，使總體積為20 μL。配制BCA工作液：計算樣品數量，將BCA試劑A與BCA試劑B按體積比50∶1配 制BCA工作液，即用即配。每個樣品加入100 μL BCA工作液，輕拍96孔板混勻，于37℃溫箱中孵育30 min。計算待測樣品總蛋白濃度：孵育結束后，于酶標儀上測定562 nm波長處的吸光度，據標準曲線計算蛋白濃度，然后用MicroBCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。按下列公式計算載藥量、包封率和質量回收率：

2.1.3 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒制備條件的優(yōu)化 在美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制備過程中，以PEG6000的含量、葡聚糖的含量以及美洲大蠊提取物多肽水溶液的配比3個因素進行單因素考察，以載藥量作為主要的考察指標進行篩選。首先以不同濃度的PEG6000溶液（5%、10%、20%）與葡聚糖溶液（5%、10%、20%）按1∶1的體積比混勻，考察是否呈乳液狀，如呈乳液狀則按PEG6000溶液∶葡聚糖溶液∶美洲大蠊提取物多肽水溶液不同體積比（1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20）制備美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒（參照“2.1.1”項下美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的制備），最后以載藥量和包封率選出最優(yōu)的實驗條件〔12〕。

2.1.4 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的顯微鏡和SEM圖像 取10.0 mg凍干好的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒放到2.0 mL的EP管里，滴加1.0 mL二氯甲烷并旋渦或超聲使美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒分散均勻，吸取0.2~0.5 mL混懸液，滴到載玻片上使美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒分散開，待二氯甲烷揮發(fā)干，用顯微鏡進行觀察、拍照。將所制備的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒樣品均勻地平鋪在粘有導電膠的鋁片上，噴金后在SEM下觀察其微觀結構，作電鏡圖像。

2.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒細胞毒性的研究

2.2.1 實時無標記細胞分析（RTCA）法檢測細胞毒性 為了檢測美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對細胞增殖的影響和細胞毒性，采用RTCA法對細胞進行動態(tài)監(jiān)測，計算細胞增殖率。取對數生長期的HepG2細胞和A549細胞接種在E-plate板上，細胞密度為5×103個/孔，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒和完全培養(yǎng)基混合至所需的最終濃度（0.000、0.016、0.032、0.064、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL），以15 min的間隔監(jiān)測給藥后24、48、72 h的動態(tài)細胞指數（CI），計算細胞存活率〔13-14〕。

2.2.2 流式細胞術檢測細胞活性 取對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板中，每孔加入2.0 mL細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/孔。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用細胞培養(yǎng)液配制美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒細胞培養(yǎng)液懸液，濃度依次為0.008、0.016、0.032、0.064、0.125 mg/mL，同時配制空白的葡聚糖微粒細胞培養(yǎng)液懸液分別加入到對應的細胞孔內，每個濃度設3個復孔，另設3個陰性對照孔。每孔2.0 mL葡聚糖微粒細胞培養(yǎng)液懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出6孔板，每孔加入500 μL胰蛋白酶消化細胞，終止消化后，用移液槍反復吹吸混勻細胞，充分保證其為單細胞狀態(tài)，收集至離心管，1 500 r/min離心3 min，用冰冷的PBS洗滌上述細胞2次，1 500 r/min離心3 min，再用500 μL PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，在避光條件下加入10 μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光反應15 min，1 h內用流式細胞儀進行觀察和檢測〔15-16〕。

2.3 統計分析采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的載藥量、包封率以不同濃度的PEG6000溶液（5%、10%、20%）與葡聚糖溶液（5%、10%、20%）按體積比1∶1混合后，10% PEG6000溶液和5%葡聚糖溶液，10%PEG6000溶液和10%葡聚糖溶液，20% PEG6000溶液和5%葡聚糖溶液混合后均呈乳液狀，此時PEG6000富集相包裹著分散的葡聚糖富集相液滴，得到白色乳液，20% PEG6000溶液和10%葡聚糖溶液混合后則出現分層。20% PEG6000溶液、10%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按不同體積比（1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20）制備美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，用MicroBCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，按公式計算載藥量分別為10.30%、28.25%、15.50%。體積比為1∶1∶10時載藥量相對較高，可選用此體積比進行后續(xù)實驗。后采用10% PEG6000溶液、5%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液，以及10% PEG6000溶液、10%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按體積比1∶1∶10制備美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，并計算載藥量分別為86.70%、73.20%，包封率分別為66.70%，53.70%。由此選出后續(xù)實驗條件：用10%PEG6000溶液、5%葡聚糖溶液和美洲大蠊提取物多肽水溶液按體積比1∶1∶10制備美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒。

3.2 美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微?；颈碚髟谕L櫥自然揮干的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒呈疏松狀，分散性較好。顯微鏡下觀察，粒徑1~5 μm；SEM下觀察，美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒排列整齊，大小無明顯差異。見圖1~2。

3.3 RTCA法檢測細胞毒性在相同濃度的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒處理下，A549細胞較HepG2細胞更敏感。給藥24 h時，美洲大蠊提取物

3.4 流式細胞術檢測細胞存活率對細胞進行FITC/PI染色，經流式細胞術檢測統計不同狀態(tài)下細胞存活數量，間接反映對細胞的毒性影響。以HepG2細胞作為細胞模型，進行美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的細胞毒性檢測實驗，在各個濃度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.40 mg/mL）下的HepG2細胞存活率分別為97.76%、86.44%、87.20%、83.48%、83.23%，表明美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對HepG2細胞無明顯細胞毒性。見圖5。

4 討論

細胞的代謝繁殖活性是細胞毒性檢測中最重要的參數，被廣泛用于藥物體外毒性評價研究。本實驗運用RTCA實時無標記細胞分析儀對細胞進行動態(tài)監(jiān)測，RTCA法與傳統的檢測方法相比具有明顯的優(yōu)勢，如操作簡單、步驟少，具有完整的細胞效應圖譜，同時提供大量、重要的動態(tài)反應信息，特別適用于腫瘤藥敏實驗。本研究結果顯示，美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對HepG2細胞未表現出顯著毒性。對HepG2細胞未表現出顯著生長抑制，但對A549細胞有一定的抑制作用，且呈劑量、時間依賴關系，這與國內報道的美洲大蠊提取物抑制腫瘤細胞增殖情況〔17〕一致。給藥24 h后時，HepG2細胞的存活率達到90%以上，這主要是由于美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒具有緩釋性，短時間內藥物不易從載體中釋放出來，故抑制作用相對較弱，但多肽葡聚糖微粒濃度達到1 000 μm/mL時對HepG2細胞無顯著毒性作用，細胞存活率仍然高達90%以上。見圖3~4。隨時間的延長，藥物釋放量逐步增加，抑制效果會逐漸顯現。用流式細胞儀進一步檢測美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對HepG2細胞活性的影響，結果表明美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒對HepG2細胞活性無顯著影響。微粒雖對細胞生長無明顯的抑制作用，但由于其緩釋作用，隨著時間的延長，藥效發(fā)揮可誘導細胞凋亡，藥物作用逐漸明顯。為后續(xù)研究美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒的藥代動力學、毒性試驗、體內靶向性抑制肝癌細胞生長及誘導癌細胞凋亡提供一定的理論基礎和參考依據。

蛋白多肽類藥物口服生物利用度普遍較低〔18〕，未來可將載藥微粒制成靜脈注射的微球制劑，一方面可以延長血液循環(huán)周期，另一方面微球制劑可穿透組織中的小毛細血管，最終在靶器官得到有效分布。本研究結果顯示，制備的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒圓整均一，平均粒徑約為5 μm，相關研究表明可用小于5 μm的固體蛋白微球作為固相，用m-S/O/W法制備微球〔19〕。接下來課題組將根據m-S/O/W法用以上實驗制備的美洲大蠊提取物多肽葡聚糖微粒，包封于與生物相容可降解的聚乳酸-羥基乙酸共聚物材料中，制備成載藥葡聚糖微球用于腫瘤的靶向治療。另外，干粉吸入劑在肺部給藥劑型的微粒尺寸需在1~5 μm〔20〕。本研究中低溫誘導相分離法制備的微?？蓾M足上述2種劑型的要求，所以該微?？赡芸梢酝ㄟ^2種給藥途徑進行給藥，為臨床應用提供更多選擇，具有廣泛的應用前景。