無莖黃芪根的化學成分生物活性研究

陳穎志，張偉，2，陳浩，單華，楊藝玲，姜北，2*

（1.大理大學藥學院，云南 大理 671000；2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南 大理 671000）

黃芪屬（Astragalus）系豆科（Leguminosae），植物種類繁多，僅我國就有400余種〔1〕，部分作為傳統(tǒng)中藥材，有多種藥用功效，其中最為常見的是中藥材正品黃芪，植物基原為膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根〔2〕。云南滇西北地區(qū)黃芪屬植物資源十分豐富，有各類黃芪屬植物近50種，但無正品黃芪自然分布〔3〕。近年來課題組對云南黃芪屬植物進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)云南黃芪屬植物化學成分復雜多樣，多數(shù)都與正品黃芪有較大差異，僅有梭果黃芪等少數(shù)黃芪屬植物在主要化學成分方面與正品黃芪具有一定的相似性〔4〕。

無莖黃芪（Astragalus acaulis）為黃芪屬華黃芪亞屬短縮莖黃芪組植物，主要分布于海拔4 000 m左右的滇西北草坡及石縫中，根生用可利水消腫，炙用可補中益氣，用于脾虛泄瀉，內(nèi)傷勞怠〔5〕，其化學成分、藥理活性迄今均無文獻報道。課題組前期研究已從無莖黃芪根甲醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇部位分離純化得到19個化合物〔6〕，其化學成分與正品黃芪有較大差異，并不具備替代正品黃芪的物質(zhì)基礎。為深入認識無莖黃芪的生物活性與藥用價值，本實驗對無莖黃芪根提取物及主要化學成分抗氧化與鎮(zhèn)痛活性進行了研究，為黃芪屬植物的開發(fā)利用提供基礎性實驗依據(jù)。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；小鼠獨立通氣籠（蘇州市蘇杭科技器材有限公司）；Varisoskan LUX多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司）；Master-S30UVF純水機（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 實驗材料96孔組織培養(yǎng)板（NEST Biotech Co.Ltd）；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH，Aldrich Chem.Co.USA，批號：D21，140-0）；阿司匹林腸溶片（沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號：國藥準字H20065051）；二甲基亞砜（天津化學試劑有限公司，批號：20070905）；維生素C（上?；瘜W試劑分裝廠，批號：84-01-10）；冰醋酸（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20150922）。

無莖黃芪根的總提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及分離純化得到的甘草素（1）、異甘草素（2）、isomucronvlatol（3）、丁香脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（4）、落葉松脂醇（5）、落葉松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（6）、5-甲氧基落葉松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（7）、對羥基苯甲醛（8）、山梨醇（9）、7β-羥基谷甾醇（10）、β-sitosteryl-D-glucoside-6'-palmitate（11）來自課題組前期研究工作〔6〕。

1.3 實驗動物SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18~22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCKY（湘）2011-0004。動物飼養(yǎng)于獨立通氣籠中，控制環(huán)境溫度（20±1）℃和相對濕度（60±5）%，標準顆粒飼料喂養(yǎng)。

2 實驗方法

2.1 小鼠鎮(zhèn)痛實驗

2.1.1 醋酸致扭體實驗 取42只昆明種小鼠，按體質(zhì)量和性別隨機分為7組：對照組，總提物組，阿司匹林組，化合物4、5、6、7組，每組6只，雌雄各半〔7〕。各組小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，進行藥物干預〔8〕。藥物均以0.9%氯化鈉溶液溶解，總提物組及化合物組灌胃給予100 mg/kg劑量的相應供試樣品；依據(jù)文獻〔7-9〕中使用劑量，阿司匹林組灌胃給予200 mg/kg阿司匹林溶液；對照組小鼠灌胃給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，給藥體積為0.2 mL/10 g〔9〕。各組小鼠在給藥1 h后，分別腹腔注射0.6%的醋酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），注射體積為0.1 mL/10 g，記錄下腹腔注射后15 min內(nèi)各組小鼠的扭體反應次數(shù)，并依據(jù)下列公式計算扭體抑制率，以評價無莖黃芪根的化學成分對醋酸致小鼠疼痛的影響〔10-11〕。扭體抑制率（%）=［（對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/對照組扭體次數(shù)］×100%。

2.1.2 小鼠熱水甩尾實驗 取42只昆明種小鼠，隨機分為對照組，阿司匹林組，總提物組，化合物4、5、6、7組，每組6只，雌雄各半。按照“2.1.1”項下的劑量對各組小鼠灌胃給予相應的供試樣品，各組小鼠在給藥前和給藥結(jié)束后60 min，分別以50℃熱水浸燙鼠尾2 cm，記錄鼠尾浸入水到甩出水的時間間隔，計算并分析小鼠對熱水的痛閾值的變化〔12〕。

2.2 體外抗氧化活性實驗參照文獻〔13〕中DPPH自由基清除實驗方法，對無莖黃芪根的總提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及11個單體化合物進行抗氧化活性測試。

2.3 統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果

3.1.1 無莖黃芪根的化學成分對醋酸致小鼠扭體的影響 無莖黃芪根的化學成分對醋酸致小鼠扭體的影響情況見表1。實驗結(jié)果顯示，對照組在15 min內(nèi)的平均扭體次數(shù)為39.6次。阿司匹林組和化合物組有明顯的扭體抑制率；無莖黃芪根的總提物和4個單體化合物均有一定的鎮(zhèn)痛活性，其中化合物7較為顯著，對小鼠扭體抑制率高達78.8%。供試樣品的活性大?。夯衔?＞總提物＞化合物5＞化合物4＞化合物6。

表1 無莖黃芪根的總提物及部分單體化合物對醋酸致小鼠扭體反應的影響（±s，n=6）

表1 無莖黃芪根的總提物及部分單體化合物對醋酸致小鼠扭體反應的影響（±s，n=6）

注：與對照組比較*P<0.05。

組別 劑量/（mg/kg） 扭體次數(shù) 扭體抑制率/%對照組 — 39.6±3.3 —阿司匹林組 200 總提物組 100 23.8±3.5* 40.3 18.8±4.7* 52.5化合物4組 100 23.0±4.2* 42.0化合物5組 100 20.8±3.9* 47.5化合物6組 100 29.0±14.8 26.8化合物7組 100 8.4±1.6* 78.8

3.1.2無莖黃芪根的化學成分對小鼠熱水甩尾的影響 無莖黃芪根的化學成分對小鼠熱水甩尾的影響情況見表2。實驗結(jié)果顯示，給藥后60 min與給藥前相比，對照組、阿司匹林組和總提物組小鼠的熱水甩尾平均痛閾值無明顯變化；化合物4、7組小鼠的熱水甩尾平均痛閾值分別提升1.84、1.25 s；化合物5、6組小鼠的熱水甩尾平均痛閾值分別下降0.93、0.89 s，表明化合物4、7具有一定的鎮(zhèn)痛活性，活性大?。夯衔?＞化合物7。

表2 無莖黃芪根的總提物及部分單體化合物對小鼠熱水甩尾反應的影響（±s，n=6）

表2 無莖黃芪根的總提物及部分單體化合物對小鼠熱水甩尾反應的影響（±s，n=6）

熱水甩尾痛閾值/s給藥前 給藥后60 min對照組 — 5.31±0.67 5.75±0.75阿司匹林組 200 6.30±1.25 5.80±1.11總提物組 100 4.50±0.83 4.67±0.31化合物4組 100 2.56±1.06 4.40±0.40化合物5組 100 3.81±1.03 2.88±0.99化合物6組 100 3.75±1.26 2.86±1.43化合物7組 100 3.50±1.07 4.75±1.41組別 劑量/（mg/kg）

3.2 體外抗氧化活性實驗結(jié)果無莖黃芪根的化學成分的抗氧化活性測試結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，無莖黃芪根的總提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位在5個濃度下（250.0 μg/mL為最高濃度，依次倍半稀釋）均有抗氧化活性，對DPPH的清除率呈一定的線性關系。其中抗氧化活性：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞總提物。11個受試化合物中有5個化合物和1組混合物對DPPH有不同程度的清除能力；化合物6和7抗氧化活性顯著，清除DPPH的平均IC50值分別為38.40、36.53 μg/mL。

表3 無莖黃芪根的總提物、萃取部位及單體化合物抗氧化活性測試結(jié)果（±s，n=3）

注：NS表示未計算出相應IC50值。

不同濃度（μg/mL）樣品對DPPH的清除率/%IC50/（μg/mL）250.0 125.0 62.5 31.3 15.6維生素C 91.37±0.07 86.82±0.00 86.15±0.01 86.08±0.00 85.19±0.00 9.17總提物 84.37±0.14 45.89±0.01 12.16±0.01 5.17±0.01 3.23±0.02 137.22乙酸乙酯部位 84.74±0.13 66.50±0.02 26.53±0.01 7.40±0.00 2.11±0.01 93.89正丁醇部位 77.22±0.20 67.70±0.01 18.64±0.02 1.52±0.01 -1.38±0.00 97.35化合物1 52.23±0.41 20.78±0.00 4.50±0.01 6.65±0.00 17.00±0.00 NS化合物2 56.45±0.38 34.94±0.01 35.39±0.00 32.33±0.00 28.67±0.02 NS化合物3和8 55.93±0.38 31.96±0.02 30.03±0.01 25.27±0.01 21.47±0.01 272.11化合物4 55.57±0.38 32.80±0.01 28.14±0.01 20.83±0.01 13.36±0.01 233.86化合物5 58.21±0.36 32.40±0.01 30.25±0.01 28.17±0.01 26.31±0.00 267.47化合物6 84.55±0.13 67.25±0.00 54.47±0.01 44.85±0.01 38.12±0.01 38.40化合物7 85.66±0.12 70.18±0.00 58.28±0.01 45.52±0.01 36.49±0.01 36.53化合物9 39.48±0.52 3.34±0.01 1.59±0.00 1.82±0.01 0.00±0.00 NS化合物10 56.45±0.38 32.41±0.00 27.65±0.01 18.86±0.01 0.63±0.01 197.39化合物11 56.46±0.37 34.13±0.01 28.96±0.00 21.63±0.01 4.78±0.01 198.48樣品名稱

4 討論

無莖黃芪成分復雜多樣，涉及黃酮、木脂素、酚性成分、三萜、甾體、脂肪酸、多元醇等多種類型。在本研究進行的醋酸致小鼠扭體、熱水甩尾和抗氧化實驗中，無莖黃芪根的提取物以及部分化合物均展現(xiàn)出較好的生物活性，特別是木脂素類化合物7，同時具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗氧化生物活性，提示無莖黃芪根在鎮(zhèn)痛、抗氧化（抗衰老）方面的潛在藥用價值，可為無莖黃芪的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。