原花青素抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)已凋亡軟骨細(xì)胞的mRNA差異表達(dá)研究

楊津先，齊志明，尹夢(mèng)虹

（1.大連市第二人民醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116000；2.大連市中心醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）屬于骨科的流行病，具有較高的發(fā)病率和患病率，影響全世界億萬(wàn)老年人的健康生活[1]。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）在OA患者軟骨的降解中起著關(guān)鍵作用，可減弱凝集素的分泌，從而降解軟骨[2]。同時(shí)，它也可以抑制軟骨表達(dá)Ⅱ型膠原以及軟骨聚集蛋白聚糖[3]，使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成不足。原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC）為抗氧化劑，可增加超氧化物歧化酶活性[4]，其抑制軟骨細(xì)胞的凋亡的作用已經(jīng)在前期的研究中被證實(shí)[5]。本研究主要對(duì)OPC抑制的由IL-1β誘導(dǎo)的已凋亡的軟骨細(xì)胞mRNA進(jìn)行相關(guān)測(cè)序分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 原花青素（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）；原代小鼠軟骨細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM/F12 （深圳博興生物科技有限公司）；胎牛血清（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；胰蛋白酶（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）；RNAiSO（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；無(wú)水乙醇（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)（青島瀚生生物科技股份有限公司）；CO2恒溫箱（上海捷諾生物科技有限公司）；低速臺(tái)式離心機(jī)（青島瀚生生物科技股份有限公司）；冷凍高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）；分光光度計(jì)（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；高壓滅菌鍋（長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片數(shù)據(jù)來(lái)源與分析 以NCBI數(shù)據(jù)平臺(tái)GEO作為數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘?qū)ο?，共挖掘?個(gè)GSE104793的數(shù)據(jù)樣本，其中3個(gè)以尚未經(jīng)過(guò)處理的原代小鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，另外3個(gè)以加入IL-1β的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用R數(shù)據(jù)庫(kù)的limma包完成差異表達(dá)分析，|log2Fold Change|＞1，采用R數(shù)據(jù)庫(kù)的Cluster Profiler包完成KEGG富集分析。

1.2.2 模型的構(gòu)建 取原代小鼠軟骨細(xì)胞，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組中的IL-1β溶液終濃度為10 μg/L；實(shí)驗(yàn)組中IL-1β濃度為10 μg/L、OPC濃度為50 μg/ml；在本研究中，前期表型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步確定了可用于小鼠IL-1B軟骨細(xì)胞凋亡模型的OPC最適合濃度[5]。兩組均放置在37 ℃、5% CO2孵箱中開(kāi)始培養(yǎng)，1個(gè)培養(yǎng)周期為24 h，培養(yǎng)周期結(jié)束后提取細(xì)胞。

1.2.3 高通量測(cè)序 按照說(shuō)明書(shū)使用RNAiSO（青島瀚生生物科技股份有限公司）提取RNA并進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，之后使用高通量測(cè)序技術(shù)，完成pooling任務(wù)后，以一邊合成一邊測(cè)序的原則來(lái)進(jìn)行Illumina測(cè)序，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，獲得fastq文件。該部分由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.4 mRNA的表達(dá)差異分析 采用fastqc進(jìn)行質(zhì)控，采用STAR軟件比對(duì)并獲得基因讀數(shù)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的樣品差異化表達(dá)檢測(cè)為采用R-3.6.2中的DESeq2包對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行差異分析（篩選條件：|log2Fold Change|＞1，顯著性P-Value＜0.05）；使用ggplots2繪制火山圖；熱圖可以把實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)的相關(guān)質(zhì)量控制以及差異數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行具像化展示。篩選表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞8，顯著性P-Value＜0.05。采用pheatmap包來(lái)確定并繪制heatmap圖。

1.2.5 功能富集分析 采用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能分類(lèi)；采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝途徑、基因產(chǎn)物功能及其相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.2.6 GSE104793與實(shí)驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因比較 GSE104793表達(dá)水平的調(diào)整及其變化趨勢(shì)均進(jìn)行記錄，同時(shí)關(guān)注與GSE104793表達(dá)水平的調(diào)整及其變化趨勢(shì)有關(guān)的基因，并繪制韋恩圖。

2 結(jié)果

2.1 GSE104793數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因及KEGG通路富集分析

2.1.1 GSE104793數(shù)據(jù)的mRNA表達(dá)量分析 共篩選出843個(gè)差異的mRNA，其中496個(gè)mRNA表達(dá)上調(diào)，347個(gè)mRNA表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖1。

圖1 GSE104793數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因火山圖

2.1.2 GSE104793數(shù)據(jù)中KEGG信號(hào)通路的富集分析 對(duì)GSE104793數(shù)據(jù)的KEGG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)mRNA主要集中在細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞粘附分子細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、細(xì)胞周期、Toll樣受體信號(hào)通路，還有癌癥的徑等信號(hào)通路上，見(jiàn)圖2。

圖2 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析圖

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 mRNA表達(dá)量的分析 662個(gè)有差異的mRNA從自測(cè)的數(shù)據(jù)中被篩選出，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中mRNA表達(dá)上調(diào)255個(gè)，mRNA表達(dá)下調(diào)407個(gè)，見(jiàn)圖3。

2.2.2 GO富集分析 GO富集分析顯示，差異表達(dá)mRNA主要集中在白細(xì)胞的遷移、單核細(xì)胞遷移等，見(jiàn)圖4A；差異表達(dá)的mRNA主要參與在細(xì)胞外基質(zhì)、膜區(qū)、膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)等，見(jiàn)圖4B。

2.2.3 KEGG信號(hào)通路的富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)mRNA主要集中在NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等信號(hào)通路上，見(jiàn)圖5。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路富集分析圖

2.3 GSE104793差異表達(dá)基因比較 差異表達(dá)mRNA篩選按以下兩條原則開(kāi)展：方法A：GSE104793中表達(dá)水平下降，但測(cè)序數(shù)據(jù)出現(xiàn)中表達(dá)水平上升，篩選交集基因9個(gè)；方法B：GSE104793中表達(dá)水平上升，但測(cè)序數(shù)據(jù)中表達(dá)水平下降，篩選交集基因29個(gè)，見(jiàn)圖6。

圖6 差異表達(dá)基因韋恩圖

3 討論

OA的臨床特征是關(guān)節(jié)出現(xiàn)疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生變性、關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥伴滑膜炎以及關(guān)節(jié)周?chē)蛙浌窍鹿堑母淖?，IL-1β與軟骨退化密切相關(guān)，在基礎(chǔ)研究開(kāi)展的過(guò)程中，也經(jīng)常被用于各種骨關(guān)節(jié)進(jìn)行性疾病的造模。有研究指出，人體關(guān)節(jié)炎發(fā)生病變的滑液中存在IL-1，其中以IL-1β為主，其存在可使得軟骨細(xì)胞產(chǎn)生變性，并且對(duì)蛋白多糖的合成以及軟骨細(xì)胞增值產(chǎn)生抑制。NF-κB也可作為IL-1主要的下游信號(hào)相關(guān)傳導(dǎo)效應(yīng)子，IκBα被IκB激酶磷酸化后，NF-κB二聚體將呈現(xiàn)暴露形態(tài)，其核定位也會(huì)相對(duì)容易，同時(shí)結(jié)合核內(nèi)DNA表達(dá)特征發(fā)生變化，疼痛骨性關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)與其活性息息相關(guān)。

研究表明OA軟骨中TLR-2和TLR-4的表達(dá)升高，抑制骨關(guān)節(jié)炎中TLR-4和NF-κB的活化可減輕炎癥、疼痛和軟骨退變[3]。同時(shí)，IL-1β mRNA表達(dá)通過(guò)TLR-4激活而增加。在OA中，細(xì)胞的外基質(zhì)合成若不足，是導(dǎo)致軟骨變性和凋亡的原因之一。本研究通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果分析，根據(jù)分析結(jié)果推測(cè)，OPC下調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞模型中相關(guān)的差異基因具有各自的生物學(xué)特征。PAK是位于人類(lèi)第18號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的基因片段，編碼具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的高度保守蛋白。在PAK相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，PAK在淋巴系統(tǒng)發(fā)育和血管內(nèi)皮生成中發(fā)揮重要作用。在軟骨細(xì)胞炎癥以及多項(xiàng)惡性炎癥研究發(fā)現(xiàn)，PAK普遍呈低表達(dá)趨勢(shì)，進(jìn)一步支持PAK是一種潛在的炎癥抑制因子。作為PAK上游的TLR/NF-κB過(guò)表達(dá)可抑制MMPs，導(dǎo)致上述炎癥細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。然而，在其他的炎癥反應(yīng)中，PAK卻表現(xiàn)出相反的作用，可能會(huì)促進(jìn)炎癥的發(fā)生[2]。

PAK的過(guò)表達(dá)與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，作者解釋這可能是炎癥起源不同所致。MMPs位于第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，其所編碼的多巴胺β羥化酶（DBH），參與機(jī)體最重要的兒茶酚胺合成代謝。交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)后神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素。MMPs是多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素的重要催化酶。在DBH缺乏的情況下，多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素路徑受阻，繼而代謝生成高香草酸（HVA）。已有研究證明，高HVA/VMA（香草扁桃酸）比值對(duì)侵襲性已凋亡軟骨細(xì)胞具有預(yù)后價(jià)值。

CNTN1位于第12號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，是一種神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族 （IgSF） 的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的神經(jīng)細(xì)胞粘附分子。目前CNTN1與炎癥的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但是有研究表明它的異常激活與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等病理表型有關(guān)。CNTN1參與惡性炎癥的各種信號(hào)通路，如VEGFC-VEFGR3/Flt4軸、PI3K/AKT通路、Notch通路和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等。

本研究不足之處：本研究屬于回顧性研究，樣本量小，存在數(shù)據(jù)偏移。此外，除了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)之外，也有許多的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)被廣泛用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)的大數(shù)據(jù)挖掘；如TARGET數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）等組織研究和建立的，它主要是利用分子特征來(lái)描述難治性?xún)和装Y發(fā)生和進(jìn)展中基因變化，后續(xù)可以對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)展開(kāi)進(jìn)一步挖掘。

綜上所述，OPC對(duì)于OA的預(yù)防、治療以及緩解機(jī)制的作用還需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。