同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒試紙條與ELISA 方法比較分析

劉衛(wèi)平

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，齊齊哈爾 161000）

馬鈴薯具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。它既可作為糧食，又可作為蔬菜，還可作為飼料和工業(yè)原料，是具有多種用途的經(jīng)濟(jì)作物；馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)成分既豐富又齊全，集蔬菜與糧食作物的優(yōu)點(diǎn)于一身，且彌補(bǔ)了蔬菜及糧食作物營(yíng)養(yǎng)中的不足。世界范圍內(nèi)，中國(guó)馬鈴薯的種植面積最大、總產(chǎn)量最高，但單產(chǎn)水平低，黑龍江省馬鈴薯單產(chǎn)水平低于世界平均單產(chǎn)水平。造成馬鈴薯單產(chǎn)水平低的主要原因是馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[1]，容易被馬鈴薯病毒侵染而退化，致使馬鈴薯的產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降。馬鈴薯病毒的檢測(cè)技術(shù)是提高馬鈴薯脫毒薯質(zhì)量的主要技術(shù)手段[2]。目前國(guó)內(nèi)外通用的檢測(cè)馬鈴薯病毒的技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)（以下簡(jiǎn)稱ELISA 方法），這是一種在實(shí)驗(yàn)室由專門的技術(shù)人員利用精密儀器才能完成的實(shí)驗(yàn)；該項(xiàng)技術(shù)不能推廣應(yīng)用普及到基層單位，大部分馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社及種植大戶不能利用這項(xiàng)技術(shù)來監(jiān)測(cè)本企業(yè)、本合作社馬鈴薯田的馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，也就不能對(duì)馬鈴薯病毒及時(shí)地進(jìn)行防控，造成馬鈴薯病毒感染，馬鈴薯田的病毒感染率超出馬鈴薯種薯的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，致使馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量差[3]，馬鈴薯單產(chǎn)水平低，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家的馬鈴薯單產(chǎn)水平。

荷蘭馬鈴薯種薯的質(zhì)量高，出口到很多國(guó)家，主要是因?yàn)楹商m有很好的馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證體系。馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證是控制馬鈴薯種薯質(zhì)量最有效的手段。利用同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條對(duì)馬鈴薯的各個(gè)級(jí)別的種薯田進(jìn)行病毒檢測(cè)，可以提高馬鈴薯種薯企業(yè)和合作社馬鈴薯種薯的質(zhì)量，使各個(gè)級(jí)別的馬鈴薯種薯的質(zhì)量達(dá)到國(guó)家種薯標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過認(rèn)證合格后，準(zhǔn)許進(jìn)入馬鈴薯種薯市場(chǎng)。為了建立我國(guó)完善的馬鈴薯種薯質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證體系，全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心為探索種子質(zhì)量認(rèn)證制度，總結(jié)種子認(rèn)證工作內(nèi)在規(guī)律，完善種子認(rèn)證程序，從2017 年開始進(jìn)行了種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的田間檢驗(yàn)，為建立健全種子認(rèn)證制度提供科學(xué)依據(jù)。參加種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的企業(yè)有雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內(nèi)蒙古坤元太和農(nóng)業(yè)科技有限公司、黑龍江萬田金農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司、依安縣天潤(rùn)薯業(yè)有限公司。參加田間檢驗(yàn)的品種有費(fèi)烏瑞它（原種、一級(jí)種）、夏波蒂（原種）、中薯5 號(hào)（原種、一級(jí)種）、興佳2 號(hào)（原種、一級(jí)種）、尤金（原種、一級(jí)種）、雪川1號(hào)（原種）、青薯9 號(hào)（原種）。通過幾年來馬鈴薯種子認(rèn)證試點(diǎn)示范項(xiàng)目的田間檢驗(yàn)，取得了良好的效果，上述企業(yè)的種薯均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以此可以帶動(dòng)所有的馬鈴薯種薯企業(yè)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)認(rèn)證；每個(gè)企業(yè)和種薯質(zhì)量監(jiān)管部門均可以利用同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒試紙條監(jiān)控馬鈴薯田6 種馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，為馬鈴薯的綜合防控和馬鈴薯種薯級(jí)別的定級(jí)提供理論基礎(chǔ)。我國(guó)馬鈴薯種薯的質(zhì)量和產(chǎn)量將有大幅度提高。

1 兩種馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)原理對(duì)比

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該方法也就是免疫層析法，現(xiàn)已發(fā)展成為常用的試紙條檢測(cè)，使用十分方便。

ELISA 方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA 檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA 方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

2 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)地點(diǎn)的對(duì)比

常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)馬鈴薯病毒只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，對(duì)于有檢測(cè)馬鈴薯病毒能力的科研單位、大學(xué)，需要到馬鈴薯田把馬鈴薯葉片采集到實(shí)驗(yàn)室即可做馬鈴薯病毒檢測(cè)；對(duì)于沒有馬鈴薯病毒檢測(cè)能力的馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社、種植大戶，需要到馬鈴薯田采集馬鈴薯葉片，進(jìn)行保鮮處理，然后將樣品送到或郵到具有馬鈴薯病毒檢測(cè)資質(zhì)的科研單位的實(shí)驗(yàn)室等候檢測(cè)。

快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒可以在任何有馬鈴薯的地方，比如田間地頭、貯藏窖、馬鈴薯的發(fā)運(yùn)地點(diǎn)、海關(guān)等地進(jìn)行就地取樣、就地檢測(cè)、就地讀取馬鈴薯病毒檢測(cè)結(jié)果，還可以及時(shí)地根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行馬鈴薯病毒的綜合防控和馬鈴薯脫毒種薯的定級(jí)。

3 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)儀器和檢測(cè)人員的對(duì)比

利用ELISA 方法進(jìn)行馬鈴薯病毒檢測(cè)必須經(jīng)過精密的高價(jià)格儀器才能讀取出檢測(cè)結(jié)果；而快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的結(jié)果讀取不需要經(jīng)過儀器，只是通過肉眼就可讀取。

ELISA 方法檢測(cè)必須要由專門的技術(shù)人員進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，需要配制多種檢測(cè)所需的試劑，需要調(diào)試并應(yīng)用多臺(tái)高精密儀器；而快速檢測(cè)馬鈴薯病毒的試紙條的使用者很廣泛，任何馬鈴薯的種植者都能夠利用該試紙條進(jìn)行馬鈴薯病毒的檢測(cè)。

4 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)費(fèi)用的對(duì)比

ELISA 方法檢測(cè)因檢測(cè)步驟繁瑣，且每個(gè)步驟孵育的時(shí)間較長(zhǎng)，完成整個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間需要2d；而快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒只需要5～10min就能完成。

ELISA 方法檢測(cè)，如果是檢測(cè)馬鈴薯的6 種主要的病毒，每份樣品需要150 元；如果馬鈴薯種薯企業(yè)、合作社以及種植大戶本身沒有檢測(cè)能力，需要將樣品送到具有馬鈴薯病毒檢測(cè)資質(zhì)的單位進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品需要480 元；如果利用本團(tuán)隊(duì)研究的同步檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條進(jìn)行馬鈴薯病毒的檢測(cè)，每份樣品只需要70 元。由此看來，利用快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的費(fèi)用是最低的。

5 兩種檢測(cè)技術(shù)靈敏度的對(duì)比

ELISA 方法檢測(cè)的靈敏度是10ng/mL，快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒的靈敏度是1ng/mL；由此看來，快速試紙條的檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)的靈敏度。

6 兩種檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果讀取方法的對(duì)比

常規(guī)的ELISA 方法檢測(cè)不能現(xiàn)場(chǎng)取樣出檢測(cè)結(jié)果，快速試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒可以現(xiàn)場(chǎng)取樣、現(xiàn)場(chǎng)出檢測(cè)結(jié)果。常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)中6 種馬鈴薯病毒需要6 個(gè)聚苯乙烯反應(yīng)板才能夠完成檢測(cè)；快速檢測(cè)試紙條馬鈴薯6 種病毒的檢測(cè)僅需要1 個(gè)試紙條就能夠檢測(cè)；常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)需要依靠?jī)x器讀取馬鈴薯病毒檢測(cè)的結(jié)果，快速檢測(cè)試紙條只靠肉眼就能讀取檢測(cè)結(jié)果。

7 快速檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

試紙條包括樣品墊、金標(biāo)墊、NC 膜、檢測(cè)線T線、質(zhì)控線C 線、吸水墊、PVC 底板。（1）將NC 膜粘貼在PVC 底板上；（2）將金標(biāo)墊搭接在NC 膜一端的上方，搭接長(zhǎng)度為1～2mm；（3）將吸水墊搭接在NC 膜另一端的上方，搭接長(zhǎng)度為2～3mm；（4）將樣品墊搭接在金標(biāo)墊的上方，搭接長(zhǎng)度為2～3mm；（5）在斬切機(jī)中將粘貼好的PVC 底板剪切成條；（6）剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋，密封后貼上標(biāo)簽。

特點(diǎn):（1）方便、適用性廣。試紙條檢測(cè)馬鈴薯病毒無需專門的技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室完成，只需馬鈴薯種植者在馬鈴薯田間即可監(jiān)測(cè)病毒的發(fā)生情況；為馬鈴薯病毒的綜合防控、馬鈴薯種薯定級(jí)提供技術(shù)支持。（2）快速。一個(gè)試紙條可在5～10min 時(shí)間內(nèi)肉眼診斷出馬鈴薯是否感染病毒。（3）靈敏度、準(zhǔn)確性高，特異性、穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)成本低。

8 討論

利用快速檢測(cè)試紙條對(duì)雪川農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司、黑龍江龍薯馬鈴薯種薯繁育有限公司、內(nèi)蒙古坤元太和農(nóng)業(yè)科技有限公司、黑龍江萬田金農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、寧夏固原天啟薯業(yè)有限公司、依安縣天潤(rùn)薯業(yè)有限公司6 個(gè)企業(yè)的馬鈴薯品種進(jìn)行了病毒檢測(cè)，馬鈴薯Y 病毒和馬鈴薯S 病毒的檢出率最高，均是9%。因?yàn)轳R鈴薯Y 病毒的傳播方式除了靠汁液摩擦傳播外，還主要依靠馬鈴薯蚜蟲傳播；馬鈴薯S 病毒是6 種馬鈴薯主要病毒中最難脫出的病毒；但是每個(gè)企業(yè)的馬鈴薯病毒的發(fā)生率均在馬鈴薯種薯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的允許范圍內(nèi)，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

同步快速檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條使馬鈴薯病毒的檢測(cè)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向田間地頭，檢測(cè)人員由專門的技術(shù)人員變?yōu)槿魏务R鈴薯種薯種植者。每個(gè)馬鈴薯種植企業(yè)和合作社均會(huì)使用該試紙條監(jiān)控和檢測(cè)馬鈴薯種薯田馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，為馬鈴薯種薯級(jí)別的定級(jí)和馬鈴薯病毒的綜合防控提供依據(jù)。每個(gè)企業(yè)可以利用試紙條了解馬鈴薯病毒的發(fā)生情況，及時(shí)采取防控措施，確保馬鈴薯種薯的質(zhì)量。同步快速檢測(cè)馬鈴薯6 種病毒的試紙條在保證馬鈴薯種薯健康中起到關(guān)鍵作用。