水產(chǎn)品中孔雀石綠污染及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

樊曉博，高紅芳

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714000；2.渭南市農(nóng)產(chǎn)品食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，陜西渭南 714000）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）是一種三苯甲烷類(lèi)有機(jī)物，在皮革、紡織、制陶等領(lǐng)域可作為工業(yè)染料[1-2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，曾用于預(yù)防和治療水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和寄生蟲(chóng)病，在運(yùn)輸和存放中也作為滅菌劑大量使用[3-4]。孔雀石綠進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)會(huì)大量聚集，通過(guò)代謝可轉(zhuǎn)化為隱性孔雀石綠，兩種物質(zhì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，存在致癌、致畸、致突變的嚴(yán)重危害[5-7]。農(nóng)業(yè)部于2002年將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》，嚴(yán)格規(guī)定其為水產(chǎn)養(yǎng)殖運(yùn)輸禁用藥物[8]。但由于其價(jià)格低廉，疾病防治效果好，違法使用的情況仍長(zhǎng)期存在[9-10]。由于工業(yè)廢水、廢渣的違法排放，水體污染和土壤污染也會(huì)造成野生水產(chǎn)動(dòng)物中孔雀石綠殘留超標(biāo)[11]。2019年7月，廣東東莞石龍鎮(zhèn)漁政大隊(duì)查獲孔雀石綠污染魚(yú)200 kg；2020年7月，香港食品環(huán)境衛(wèi)生署食物安全中心在皖魚(yú)樣本中檢測(cè)出微量孔雀石綠。因此，水產(chǎn)品中孔雀石綠的監(jiān)管工作仍需加強(qiáng)。本文圍繞孔雀石綠的污染情況及殘留檢測(cè)技術(shù)展開(kāi)綜述。

1 各地區(qū)水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況

由于孔雀石綠可有效治療和預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物相關(guān)疾病，在養(yǎng)殖和運(yùn)輸過(guò)程中違禁使用孔雀石綠的情況仍層出不窮。針對(duì)淡水魚(yú)類(lèi)孔雀石綠污染情況的調(diào)查研究，可以為相關(guān)部門(mén)的整治工作提供數(shù)據(jù)支持，提升水產(chǎn)品的安全指數(shù)。

綜合近幾年不同地區(qū)的調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，珠三角地區(qū)市售淡水魚(yú)中孔雀石綠污染情況比較嚴(yán)重，深圳市持續(xù)3年監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)污染率達(dá)8.82%，特別是深圳市羅湖區(qū)，抽取173份淡水魚(yú)樣品檢測(cè)，檢出率高達(dá)41.62%[12-13]。由于珠三角地區(qū)天氣炎熱潮濕，居民魚(yú)類(lèi)消費(fèi)量大，魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖密度高，更易滋生魚(yú)類(lèi)水霉病菌，因此在養(yǎng)殖過(guò)程中違法使用孔雀石綠的情況對(duì)比其他地區(qū)更加嚴(yán)重，且在運(yùn)輸過(guò)程中為了保持魚(yú)類(lèi)的存活率也可能存在違規(guī)使用的情況。其中污染最嚴(yán)重的魚(yú)類(lèi)是桂花魚(yú)，平均污染率為20%，羅湖區(qū)更高達(dá)70%以上[12]。除此之外，羅湖區(qū)黃骨魚(yú)、脆肉魚(yú)和生魚(yú)中孔雀石綠檢出率也比較高，均在40%以上[13]。不同魚(yú)類(lèi)存在生理差異，檢出率高的魚(yú)類(lèi)疾病易感性強(qiáng)。此外，氣溫低的冬春季節(jié)魚(yú)類(lèi)發(fā)病率更高，因此采樣時(shí)間也會(huì)影響調(diào)查結(jié)果。長(zhǎng)三角地區(qū)孔雀石綠殘留率較低，上海市市售的大菱鲆、烏鱧和鱖魚(yú)中孔雀石綠檢出率為1.3%，遠(yuǎn)低于同期開(kāi)展調(diào)查的武漢市（8.93%）和陜西?。?.32%）[14-16]，由于上海市多次開(kāi)展“三魚(yú)兩藥”專(zhuān)項(xiàng)整治工作，違禁藥物的使用得到了很好的控制。

通過(guò)對(duì)不同地區(qū)淡水魚(yú)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同省市主要污染的魚(yú)類(lèi)有很大的差異，這與各個(gè)地區(qū)飲食偏好相關(guān)性高，水產(chǎn)品消費(fèi)量高的地區(qū)比消費(fèi)量低的地區(qū)污染嚴(yán)重，例如寧夏的肉類(lèi)消費(fèi)主要是牛羊肉，水產(chǎn)品消費(fèi)相對(duì)較低。祁萍等[17]2010—2017年對(duì)1 400份成魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明孔雀石綠的殘存率僅有0.21%。各個(gè)地區(qū)淡水魚(yú)中均能檢出孔雀石綠殘留，總體污染情況比較嚴(yán)重，但根據(jù)居民的平均食用量進(jìn)行膳食暴露評(píng)估，居民淡水魚(yú)孔雀石綠暴露健康風(fēng)險(xiǎn)較低。由于孔雀石綠存在致癌危害，相關(guān)部門(mén)還需要加強(qiáng)監(jiān)管，借鑒上海市整治工作成效，對(duì)市場(chǎng)流通量大的魚(yú)類(lèi)、易感率高的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖和銷(xiāo)售人員的宣傳教育，從源頭杜絕污染水產(chǎn)品的流通。

2 孔雀石綠的檢測(cè)技術(shù)

2.1 儀器分析法

孔雀石綠及其代謝物的檢測(cè)主要以光譜、色譜和質(zhì)譜為代表的儀器方法為主[18-19]。其中，常用的有高效液相法[20]、氣相質(zhì)譜法[21]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[22-24]等。儀器法均需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，色譜分離后進(jìn)行檢測(cè)，一般耗時(shí)較長(zhǎng)，操作煩瑣。為了改善儀器法耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，各種研究不斷優(yōu)化前處理方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間[25]。樣品前處理中通常以乙腈[26]作為提取溶劑，可以利用乙腈的極性沉淀組織樣品中的蛋白質(zhì)，提取效果好。提取 液 可 以 通 過(guò)QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法除雜。陳永平等[27]利用乙二胺-N-丙基硅烷吸附凈化提取液，在液相和質(zhì)譜條件下可以同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中2種孔雀石綠和3種酰胺醇類(lèi)抗生素殘留。此外，也可以通過(guò)固相萃取的方法除雜，如中性氧化鋁固相萃取小柱[28]、分散固相萃取凈化管[29]和丙磺酸固相萃取柱[30]等，均可以極大地簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了有機(jī)溶劑的用量。樣品經(jīng)色譜柱分離后，進(jìn)入質(zhì)譜條件檢測(cè)，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量，可建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留。林侃等[28]以氘代內(nèi)標(biāo)物標(biāo)記，利用此法檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的檢出限為0.02 μg/kg，靈敏度高于國(guó)標(biāo)方法。

近年來(lái)，一種新型的敞開(kāi)式電離質(zhì)譜在食品成分檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，這種技術(shù)是一種常壓敞開(kāi)式離子化技術(shù)，無(wú)需前處理或僅需簡(jiǎn)單的預(yù)處理，可以直接實(shí)現(xiàn)固體表面待測(cè)物的離子化，在短時(shí)間內(nèi)完成待測(cè)樣品中目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測(cè)[31]。對(duì)于直接的離子源而言，樣品在電場(chǎng)中可以被直接電離。養(yǎng)殖水中的孔雀石綠可以通過(guò)紙噴霧質(zhì)譜技術(shù)篩查，紙噴霧電離技術(shù)將待測(cè)物加載于固相載體上，可以避免發(fā)生毛細(xì)管阻塞等問(wèn)題，檢測(cè)更加快捷。曾棟等[32]將樣品制備液加載于紙基上，在高壓電場(chǎng)中目標(biāo)物以電噴霧的形式進(jìn)入質(zhì)譜測(cè)定，可在1 min內(nèi)檢測(cè)單個(gè)樣品。直接解吸電離離子源是一種采用介質(zhì)阻擋放電的敞開(kāi)式電離質(zhì)譜技術(shù)，以氦氣作為離子化氣體，實(shí)現(xiàn)分析物的表面解吸電離。蘇晶等[33]優(yōu)化質(zhì)譜條件檢測(cè)樣品中的孔雀石綠及隱性孔雀石綠，不需要色譜分離過(guò)程，可在10～15 min內(nèi)完成檢測(cè)。

2.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜

拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一種高效分子振動(dòng)光譜，在膠體金、銀、銅等金屬顆粒粗糙表面會(huì)發(fā)生拉曼強(qiáng)度極大增強(qiáng)的現(xiàn)象，這種效應(yīng)稱(chēng)為表面增強(qiáng)拉曼散射[34]。利用表面增強(qiáng)拉曼光譜可識(shí)別分子特征結(jié)構(gòu)信息，無(wú)需復(fù)雜前處理，實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)[35-38]。這種檢測(cè)技術(shù)的基底部分在檢測(cè)中起到了至關(guān)重要的作用，可以提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此基底的研究是該技術(shù)的重點(diǎn)。

目前檢測(cè)中常用的是金屬膜基底，這種基底制備對(duì)儀器、試劑和人員的要求較低[39]。吳煥樂(lè)等[40]在聚二甲基硅氧烷薄片表面采用葡萄糖還原硝酸銀沉積銀納米離子制備SERS基片，對(duì)鯽魚(yú)中孔雀石綠及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)。金納米離子作為SERS基底的研究也引起廣泛關(guān)注。趙靜晨等[41]利用表面活性劑合成樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的金納米離子SERS基底。XU等[42]開(kāi)發(fā)了金納米棒SERS基底，均可以快速靈敏地檢測(cè)魚(yú)肉樣品中的孔雀石綠殘留。由于金屬基底的成本較高，出現(xiàn)了金屬與非金屬組成的復(fù)合基底[43]。ZHAO等[44]在石英片上合成了金納米離子與氧化石墨烯的復(fù)合基底，以結(jié)晶紫為探針，可以檢測(cè)5種魚(yú)類(lèi)的孔雀石綠殘留。除此之外，表面增強(qiáng)拉曼光譜也可與其他技術(shù)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)便攜式、手提式拉曼儀的開(kāi)發(fā)。關(guān)琪等[45]制備了金納米顆粒@多孔銀纖維絲雙功能基底，將固相微萃取技術(shù)與表面增強(qiáng)拉曼光譜聯(lián)用，在電場(chǎng)作用下，可以在1 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物的富集和檢測(cè)。

2.3 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)可以通過(guò)模擬抗原-抗體間特異性結(jié)合模式制備三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)聚合體，對(duì)靶分子進(jìn)行選擇性識(shí)別，其基本原理為“鎖鑰模型”，也被稱(chēng)為“仿生抗體”[46-47]。分子印跡聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）性能穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，適用范圍廣，在食品檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。表面印跡技術(shù)是最常用的分子印跡制備方法，在選定的載體材料表面形成分子印跡聚合物，常用的載體材料有磁性納米粒子、碳納米管等。章琦[48]利用多巴胺分子制備分子印跡材料，以磁性Fe3O4納米顆粒固定孔雀石綠模板分子，形成磁性分子印跡聚合物，為檢測(cè)孔雀石綠樣品提供新的前處理方法。

量子點(diǎn)（Quantum Dots，QDs）是一種具有熒光的半導(dǎo)體納米晶體材料，光化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，利用其熒光特性制備的量子點(diǎn)熒光探針在食品、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用非常廣泛，但量子點(diǎn)熒光探針對(duì)目標(biāo)物的特異性較差，將量子點(diǎn)熒光探針與分子印跡技術(shù)結(jié)合形成復(fù)合材料，可以兼具高靈敏度和高選擇性。RAN等[49]以MG為模板，采用不同的功能單體，以SiO2和聚苯乙烯微球（Polystyrene Microspheres，PS）為載體，CdTe QDs和碳點(diǎn)CDs為熒光光源，采用沉淀聚合法制備了核-殼結(jié)構(gòu)MIP@SiO2@CdTe熒光分子探針，溶膠-凝膠法制備了核-殼結(jié)構(gòu)比率熒光探針MTP@PS-QDs&CDs，反相微乳法制備雙發(fā)射比率分子印跡探針MIPs@gQDs&rQDs，3種探針均能成功用于魚(yú)肉樣品中MG的檢測(cè)。除了熒光型分子探針外，LUO等[50]合成了具有磷光性質(zhì)的光學(xué)傳感元件摻雜量子點(diǎn)Mn-ZnS QDS，通過(guò)反相乳液法將Mn-ZnS QDs與分子印跡聚合物結(jié)合，制備了能識(shí)別水和魚(yú)類(lèi)體內(nèi)孔雀石綠的MIP-coated QDs，這種磷光分子探針可以避免樣品基質(zhì)中的背景熒光干擾，為樣品中MG的檢測(cè)提供了新思路。

2.4 分子識(shí)別技術(shù)

分子識(shí)別技術(shù)是指通過(guò)高特異性、高選擇性的結(jié)合目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的分析方法，食品檢測(cè)中常用的分子識(shí)別技術(shù)是基于抗原-抗體的酶聯(lián)免疫法[51-52]。酶聯(lián)免疫法可以與量子點(diǎn)、磁性納米顆粒聯(lián)用，使傳統(tǒng)免疫檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度不斷得到提升。陳義元等[53]利用磁性納米球與包被抗原偶聯(lián)制備感應(yīng)探針，以ZnCdS量子點(diǎn)作為標(biāo)記物偶聯(lián)孔雀石綠抗體制備信號(hào)探針，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度建立了間接競(jìng)爭(zhēng)熒光標(biāo)記磁分離免疫分析方法，可以測(cè)定魚(yú)類(lèi)和蝦肉中MG殘留，檢測(cè)限為0.012 μg/L。生物素-親和素系統(tǒng)與ELISA結(jié)合，通過(guò)生物素標(biāo)記，親和素識(shí)別多個(gè)生物素，結(jié)合酶標(biāo)記實(shí)現(xiàn)雙信號(hào)放大，提升ELISA方法的靈敏度。楊光昕等[54]通過(guò)N-羥基琥珀酸生物素制備生物素化抗體，利用酶標(biāo)記親和素雙重識(shí)別建立生物素-鏈霉親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法，可以測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫含量。

隨著核酸操控技術(shù)的飛速發(fā)展，多種體外技術(shù)克服了單克隆抗體技術(shù)的各種缺陷，出現(xiàn)了核酸適配體這種新型分子識(shí)別元件，是一種可以穩(wěn)定結(jié)合目標(biāo)抗原的單鏈RNA或DNA分子[55-56]。核酸適配體的目標(biāo)分子范圍極廣，包括各種有機(jī)小分子、蛋白、組織和細(xì)胞等，具有高特異性、易于化學(xué)修飾、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，在傳感檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用前景[57]。近年來(lái)，以膠體金作為指示載體的比色核酸適配體傳感器廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中MG的檢測(cè)。趙晨等[58]利用MG-RNA適配體結(jié)合膠體金建立可視化生物傳感器檢測(cè)方法，當(dāng)樣品中存在孔雀石綠時(shí)，檢測(cè)溶液由紅色變成藍(lán)色，可實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)。吳文偉等[59]采用雙特異性核酸適配體（Aptamer3，A3）作為傳感探針，利用納米金光學(xué)特性，比色法可同步檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留。這種方法具有操作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，比色核酸適配體傳感器具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.5 電化學(xué)傳感器法

電化學(xué)傳感器是利用待測(cè)組分電信號(hào)的變化進(jìn)行檢測(cè)，具有高靈敏度、高選擇性及成本低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為藥物殘留檢測(cè)的重要工具[60]。電化學(xué)法常以聚合材料及納米材料制備電極。尚晶晶等[61]采用殼聚糖和石墨烯修飾玻碳電極，制備納米修飾電極，以隱性孔雀石綠電化學(xué)性質(zhì)測(cè)定水產(chǎn)品中2種孔雀石綠殘留。電化學(xué)法可與分子印跡技術(shù)結(jié)合，陳宏等[62]用聚合鄰氨基酚在玻碳電極表面制備分子印跡膜，構(gòu)建了MG分子印跡電化學(xué)傳感器，電極可以更好地捕獲待測(cè)物，檢測(cè)特異性高。

2.6 直讀顯色檢測(cè)法

新型的直讀顯色的檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速分析，結(jié)合待測(cè)組分時(shí)會(huì)引起顏色顯著變化，通過(guò)目視即可判斷結(jié)果，具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[63]。賴(lài)姝毓等[64]制備了碘酸鉀@二氧化鈦納米復(fù)合顯色材料，首次提出了基于薄層色譜圖像分析的孔雀石綠半定量快速檢測(cè)方法，為后期實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)中MG的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了新途徑。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)不同地區(qū)市售水產(chǎn)品中孔雀石綠污染情況的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，雖然從膳食暴露水平評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)較低，但是水產(chǎn)品的污染情況不容樂(lè)觀，污染率偏高。相關(guān)部門(mén)要從源頭加強(qiáng)監(jiān)測(cè)力度，打擊違法使用孔雀石綠的行為，不斷提升對(duì)檢測(cè)技術(shù)的要求?？兹甘G及其代謝物檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展優(yōu)化，儀器法中超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法得到了廣泛應(yīng)用，簡(jiǎn)單快速的敞開(kāi)式電離質(zhì)譜技術(shù)也日趨成熟，極大地簡(jiǎn)化了儀器法的檢測(cè)流程；表面增強(qiáng)拉曼光譜無(wú)需前處理，可實(shí)現(xiàn)快速無(wú)損檢測(cè)；分子印跡技術(shù)特異性強(qiáng)，制備簡(jiǎn)單，可與量子點(diǎn)、磁性粒子結(jié)合對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行高選擇性檢測(cè)；核酸適配體技術(shù)通過(guò)化學(xué)合成，在適宜的體外條件下篩選特定靶分子，與傳統(tǒng)的抗體相比檢測(cè)范圍更廣；電化學(xué)檢測(cè)與傳感器等新方法聯(lián)用是一種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法；新型的直讀顯色檢測(cè)方法的出現(xiàn)也為孔雀石綠的即時(shí)檢測(cè)提供了可能。各種新技術(shù)的出現(xiàn)及不同技術(shù)的相互融合擴(kuò)大了檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)。在未來(lái)的檢測(cè)中，操作簡(jiǎn)單、便于攜帶、檢測(cè)快速及結(jié)果直觀準(zhǔn)確是今后技術(shù)的發(fā)展方向，量子點(diǎn)、納米技術(shù)、核酸適配體及傳感器技術(shù)等也將在未來(lái)的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。