石斛內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

劉 雪

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東濟(jì)南 250000）

石斛（Dendrobium）為附生型多年生草本植物，為蘭科最大的屬之一，主要有鐵皮石斛、流蘇石斛、環(huán)草石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和黃草石斛等，在我國(guó)主要分布于秦嶺-淮河以南，集中在云、貴、桂、瓊、粵和臺(tái)等地區(qū)。石斛是傳統(tǒng)名貴藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“味甘，平”“久服厚腸胃，輕身延年”。2020版《中國(guó)藥典》記載，石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效?，F(xiàn)代科學(xué)研究證明石斛含有豐富的多糖、生物堿、黃酮、倍半萜類和菲類等活性成分，在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和增強(qiáng)抵抗力等方面作用顯著。因其良好的食用和藥用效果，石斛被國(guó)家藥監(jiān)局列入“藥食同源”名單。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，對(duì)寄主植物產(chǎn)生直接或間接作用，不會(huì)引起明顯病害的一類微生物群。石斛內(nèi)生菌是影響石斛生長(zhǎng)與藥效的重要生態(tài)因素之一，近年來學(xué)者對(duì)石斛內(nèi)生菌的分離鑒定及其與石斛的互惠共生關(guān)系進(jìn)行研究，取得了較為豐富的成果。

1 石斛內(nèi)生菌

石斛內(nèi)生菌資源豐富，在植株的根莖葉中都有分布，目前研究主要集中于鐵皮石斛、霍山石斛、金釵石斛、齒瓣石斛、束花石斛、美花石斛和細(xì)莖石斛等藥用石斛方面。不同石斛由于品種及生存環(huán)境等差異，其內(nèi)生菌的種類和數(shù)量差別較大，野生石斛內(nèi)生菌物種多樣性指數(shù)高于人工栽培品種。

1.1 石斛內(nèi)生真菌

自20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)石斛內(nèi)生菌開始，學(xué)者先后從鐵皮石斛、美花石斛、金釵石斛等石斛中分離出眾多內(nèi)生真菌，形成了較為成熟的分離鑒定方法[1]。石斛內(nèi)生真菌的種群豐富多樣，主要有擔(dān)子菌亞門、子囊菌亞門和半知菌亞門，涵蓋小菇屬、絲核菌屬、木霉屬、柱孢霉屬和頭孢霉屬等近60個(gè)屬[2]。石斛內(nèi)生真菌有一定的宿主及組織特異性，不同品種及同一品種不同組織中的內(nèi)生真菌差異較大。嚴(yán)亮等[3]研究云南栽培的鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)其根部的內(nèi)生菌的種類、數(shù)量最多。有學(xué)者從金釵石斛中發(fā)現(xiàn)14個(gè)屬的內(nèi)生真菌，且在葉組織中分布數(shù)量最多[4]。柴曉蕾等[5]研究華石斛野生植株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)葉中分離出的菌株數(shù)最多。這些差異可能與宿主石斛的基因、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)年限等因素有關(guān)，也可能與篩選方法等操作因素有關(guān)。

1.2 石斛內(nèi)生細(xì)菌

石斛內(nèi)生細(xì)菌主要有厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，涵蓋芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、短小桿菌屬等近50個(gè)屬，在多個(gè)石斛品種中，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。研究表明，石斛內(nèi)生細(xì)菌表現(xiàn)出地區(qū)、種屬特異性及組織偏嗜性，與藥材的道地性相符合。童文君等[6]從不同產(chǎn)地美花石斛的不同部位中分離出內(nèi)生細(xì)菌67株，分布情況為莖部多于根部和葉部，來自廣西的種類數(shù)多于云南和廣東。王明月等[7]對(duì)人工種植的鐵皮石斛研究發(fā)現(xiàn)，其根組織中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量高于莖和葉，且格氏沙雷氏菌和蘇云金芽孢桿菌僅存在于根組織。

1.3 不可培養(yǎng)內(nèi)生菌

由于培養(yǎng)條件等因素限制，傳統(tǒng)方法只能篩選到植物內(nèi)生菌的1%左右。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA測(cè)序、熒光標(biāo)記、酶聯(lián)免疫反應(yīng)等技術(shù)在內(nèi)生菌的鑒定、“不可培養(yǎng)內(nèi)生菌”的研究方面實(shí)現(xiàn)了新突破。通過高通量測(cè)序可構(gòu)建不同品種石斛的內(nèi)生菌cDNA文庫(kù)，使篩選更準(zhǔn)確、高效。有學(xué)者通過MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析鐵皮石斛的內(nèi)生細(xì)菌，檢測(cè)到低豐度的、從未分離鑒定過的瘤胃球菌屬、布赫納氏菌屬等細(xì)菌類群[8]。通過微生物多樣性測(cè)序技術(shù)，王珊珊等[9]從6種石斛莖部組織中檢測(cè)到從未報(bào)道過的叢毛單胞菌屬及羅爾斯通菌屬菌株。分子生物學(xué)技術(shù)尤其是DNA測(cè)序和基因圖譜等技術(shù)為石斛內(nèi)生菌的研究提供了新的思路和方向。

2 石斛內(nèi)生菌的作用

2.1 促進(jìn)石斛植株的生長(zhǎng)發(fā)育

石斛作為蘭科植物，種子沒有胚乳，其生活史與微生物的共生關(guān)系十分緊密。在長(zhǎng)期的系統(tǒng)演化過程中，內(nèi)生菌既可產(chǎn)生植物激素、維生素等促進(jìn)石斛的生長(zhǎng)發(fā)育，又可增強(qiáng)石斛對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收。在鐵皮石斛、金釵石斛、齒瓣石斛等篩選到的多種內(nèi)生菌都對(duì)石斛的萌發(fā)、生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。SHAH等[10]從細(xì)莖石斛中分離到內(nèi)生真菌R10，研究發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生相對(duì)較高的植物生長(zhǎng)素吲哚乙酸。金輝等[11]將內(nèi)生瘤菌根菌人工接種至鐵皮石斛的組織培養(yǎng)苗，發(fā)現(xiàn)接菌苗的B、Fe、Cu和Mn等多種營(yíng)養(yǎng)元素含量有所增加，其中B、Si元素含量分別增加了7.8倍和5.3倍。把從野生鐵皮石斛中分離的內(nèi)生菌接入人工栽培植株，可提高栽培鐵皮石斛內(nèi)生菌多樣性，還能使石斛在轉(zhuǎn)錄水平上的代謝途徑發(fā)生基因差異表達(dá)。

2.2 增強(qiáng)石斛的抗逆性

石斛內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)宿主植物抵抗病原菌和抗干旱能力。部分石斛內(nèi)生菌有較強(qiáng)的抗病原菌能力，金釵石斛和流蘇石斛中均發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生廣譜抗菌活性物質(zhì)的內(nèi)生細(xì)菌。朱江敏等[12]發(fā)現(xiàn)石斛內(nèi)生木霉菌能夠抑制病原真菌鐮刀菌，能有效提高石斛抗病能力。除通過分泌抗生素類物質(zhì)外，石斛內(nèi)生菌還能通過產(chǎn)生水解酶、毒性生物堿，或者生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)等途徑實(shí)現(xiàn)抗病性，是研發(fā)新型天然抗生素的寶貴資源。研究發(fā)現(xiàn)美花石斛的內(nèi)生菌有較廣的pH適應(yīng)范圍，還能誘導(dǎo)石斛產(chǎn)生能參加抗性反應(yīng)的小分子酚類化合物，從而抵抗惡劣環(huán)境，這也是多數(shù)石斛能生長(zhǎng)在樹皮上、石灰?guī)r基質(zhì)中的重要因素。

2.3 促進(jìn)石斛活性代謝產(chǎn)物的合成

藥用石斛中生物堿、多糖、黃酮類和聯(lián)芐類是主要的次生代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌能夠影響宿主石斛的次生代謝水平、誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的合成。CHEN等[13]發(fā)現(xiàn)石斛內(nèi)生菌小菇屬M(fèi)F24菌株和瘤菌根屬M(fèi)F15菌株可使金釵石斛的多糖含量分別提高76.7%和153.4%。WU等[14]從鐵皮石斛分離內(nèi)生菌并用其侵染栽培植株，明顯提高了栽培植株莖部的多糖及葉部的酚類、黃酮類的含量。用石斛內(nèi)生菌MF23侵染金釵石斛后，可通過調(diào)節(jié)甲羥戊酸途徑中與生物堿合成相關(guān)的基因的表達(dá)，增加金釵石斛生物堿的合成[15]。研究認(rèn)為內(nèi)生菌通過一種化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)因子，能快速且特異性地誘導(dǎo)石斛植株特定基因表達(dá)、激活特定次生代謝途徑，促進(jìn)相應(yīng)成分的合成和積累。

2.4 產(chǎn)生其他功能性產(chǎn)物

現(xiàn)代研究證明石斛內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種功能性產(chǎn)物，石斛內(nèi)生菌具有與藥用石斛相似的鎮(zhèn)痛消炎作用，從石斛內(nèi)生菌石斛小菇發(fā)酵產(chǎn)物中提取出有明顯鎮(zhèn)痛作用的單體化合物β-谷甾醇和麥角甾烯氧化物。WU等[16]研究發(fā)現(xiàn)分離自鐵皮石斛內(nèi)生真菌DO14代謝產(chǎn)物的5種化合物，對(duì)兩種人癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞、HL-60細(xì)胞）有不同程度的抑制作用。有的內(nèi)生菌可以代謝出天然色素，如鐵皮石斛內(nèi)生真菌H1B1可分泌耐高鹽高糖的水溶性紅色素[17]。多樣性的代謝產(chǎn)物對(duì)醫(yī)藥資源及工業(yè)生產(chǎn)具有重要研究?jī)r(jià)值。

3 結(jié)語

石斛內(nèi)生菌在宿主石斛的生長(zhǎng)及代謝中起著不可替代的作用，加強(qiáng)對(duì)內(nèi)生菌的研究利用對(duì)保護(hù)石斛資源、拓寬其生物多樣性具有重要意義。目前，石斛及其內(nèi)生菌相互作用機(jī)制、多種內(nèi)生混合菌株的協(xié)同機(jī)制尚不明確，有效利用內(nèi)生菌資源提高石斛的品質(zhì)有待繼續(xù)探究，其在石斛內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的藥理作用、有關(guān)功能基因的克隆與表達(dá)、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)提取相關(guān)功能性成分等方面，將有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。