磷酸化GluN2B亞基在α-syn A53T轉(zhuǎn)基因小鼠黑質(zhì)中的表達變化

張佳惠 劉恒 王玉田 姜宏

[摘要] 目的 研究帕金森病轉(zhuǎn)基因模型小鼠中腦黑質(zhì)（SN）區(qū)磷酸化GluN2B（p-GluN2B）亞基的蛋白含量變化。

方法 實驗所用動物為12～15月齡α-突觸核蛋白（α-syn）A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩野生型（WT）小鼠。利用開放曠場實驗檢測小鼠的運動行為能力，采用蛋白免疫印跡法檢測小鼠SN區(qū)p-GluN2B及磷酸化α-syn（pS129 α-syn）蛋白表達。

結(jié)果 與WT小鼠相比，α-syn A53T轉(zhuǎn)基因小鼠曠場總運動距離減少（t=2.920，P＜0.05），平均運動速度減慢（t=2.518，P＜0.05），中腦SN區(qū)p-GluN2B和pS129 α-syn蛋白表達量明顯升高（t=2.470、3.533，P＜0.05）。

結(jié)論 α-syn A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠SN區(qū)GluN2B亞基活性增強且可能參與多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程。

[關(guān)鍵詞] 帕金森??；小鼠，轉(zhuǎn)基因；黑質(zhì)；α突觸核蛋白；GluN2B

[中圖分類號] R338.2

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）05-0643-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.166

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20221021.1358.001.html;2022-10-24 09：36：11

CHANGE IN THE EXPRESSION OF PHOSPHORYLATED GLUN2B SUBUNIT IN THE SUBSTANTIA NIGRA OF α-SYNUCLEIN A53T TRANSGENIC MICE

ZHANG Jiahui， LIU Heng， WANG Yutian， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）;

[ABSTRACT] Objective To investigate the change in the expression of phosphorylated GluN2B （p-GluN2B） subunit in the substantia nigra （SN） of transgenic mice with Parkinsons disease （PD）.

Methods The α-synuclein （α-syn） transgenic mice and wild-type （WT） littermates， aged 12-15 months， were used in this experiment. The open field test was used to observe motor behavior abilities， and Western blotting was used to measure the protein expression of p-GluN2B and phosphorylated α-syn （pS129 α-syn） in the SN of mice.

Results The open field test showed that compared with the WT mice， the α-syn A53T transgenic mice had significant reductions in total movement distance （t=2.920，P<0.05） and mean movement speed （t=2.518，P<0.05）， and Western blotting showed that compared with the WT mice， the α-syn A53T transgenic mice had significant increases in the protein expression levels of p-GluN2B and pS129 α-syn in the SN of the midbrain （t=2.470，3.533;P<0.05）.

Conclusion The activity of GluN2B subunit in the SN of α-syn A53T transgenic mice is enhanced， which may be involved in the degeneration and death of dopaminergic neurons.

[KEY WORDS] Parkinson disease; mice， transgenic; substantia nigra; alpha-synuclein; GluN2B

在帕金森?。≒D）中，α-突觸核蛋白（α-syn）在Ser-129 位點的磷酸化促進了α-syn的積累及路易小體的形成，對PD的發(fā)生發(fā)展起到重要作用^[1-4]。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體為離子型谷氨酸受體，具有高鈣離子通透性，在學(xué)習(xí)與記憶中發(fā)揮重要作用^[5-6]。該受體過度激活會導(dǎo)致細胞功能障礙和死亡，被認為是與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的神經(jīng)元損傷的介質(zhì)^[7-8]。NMDA受體GluN2B亞基的C末端可以被酪氨酸激酶Fyn激活而發(fā)生磷酸化聚集在突觸后膜上，而細胞內(nèi)Fyn的表達可能受到α-syn的調(diào)控^[9-10]。然而，NMDA 受體參與PD的發(fā)病機制仍然不明確。本實驗旨在通過檢測α-syn A53T 轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型（WT）小鼠黑質(zhì)區(qū)（SN）磷酸化GluN2B（p-GluN2B）蛋白表達水平，探究隨PD進展GluN2B亞基活性變化，以期為PD提供潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 α-syn A53T轉(zhuǎn)基因小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所，進行基因型鑒別，獲得α-syn A53T^+/+小鼠和α-syn A53T^＋/－小鼠。本實驗選擇12～15月齡的α-syn A53T^+/+小鼠和同窩WT小鼠各5只作為研究對象。小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，設(shè)定室溫為（22±2）℃、白晝與黑夜的光照時間為1∶1。

1.1.2 儀器及試劑 p-GluN2B抗體（ABcam）；磷酸化α-syn（pS129 α-syn）抗體、GAPDH抗體（Cell Signaling Technology）；山羊抗兔二抗（Absin）；BCA試劑盒、SDS-PAGE loading buffer、RIPA裂解液、分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液（康為世紀）；ECL顯色發(fā)光液、PVDF膜（Millipore）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（BioRad）；凝膠成像系統(tǒng)（General Electric Company）。

1.2 實驗方法

1.2.1 曠場實驗 應(yīng)用50 cm×50 cm的方盒曠場，方盒周壁及底部的顏色均不透明，將方盒底部平均分為4×4的16個小方格。攝像頭置于方盒上方，可觀察整個曠場，將小鼠輕輕放置在方盒中，黑暗中進行10 min的視頻錄制。每只小鼠測試結(jié)束后，清理方盒并應(yīng)用乙醇消除氣味后晾干，以防對下一只小鼠測試產(chǎn)生影響。采用SMART軟件分析小鼠總運動距離及平均運動速度等數(shù)據(jù)。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測SN區(qū)蛋白表達 小鼠麻醉后斷頭取腦，在冰上按照腦圖譜完整取出中腦SN區(qū)。向腦組織中加入100 μL RIPA蛋白裂解液靜置，置于研磨機中研磨。在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，離心結(jié)束后取上清液80 μL，在酶標儀上用BCA 法測定蛋白濃度。加入5×蛋白loading buffer混勻，100 ℃金屬浴煮沸，根據(jù)BCA法檢測數(shù)據(jù)確定上樣量。按照所需蛋白分子量配膠，電泳完成以后轉(zhuǎn)膜（300 mA、100 min）。按照Marker切下需要的目標條帶，用100 g/L脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h；分別加入用一抗稀釋液配制的p-GluN2B抗體（1∶1 000）、pS129 α-syn 抗體（1∶1 000）、GAPDH抗體（1∶10 000），置低速搖床上4 ℃孵育過夜；以TBST緩沖液洗脫3次，半小時后加入山羊抗兔的二抗（1∶10 000，TBST緩沖液配制），置搖床上室溫孵育1 h；以TBST緩沖液洗脫3次，擦干TBST后，加入適量ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影。采用Image J軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以p-GluN2B、pS129 α-syn與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料結(jié)果以±s表示，兩組比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α-syn A53T^+/+小鼠運動行為能力改變

α-syn A53T^+/+小鼠和WT小鼠在開放曠場的總運動距離分別為（2 575.0±293.7）、（3 655.0±225.1）cm（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠曠場總運動距離較WT小鼠減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.920，P＜0.05）。α-syn A53T^+/+小鼠和WT小鼠的平均運動速度分別為（4.302±0.480）、（5.898±0.415）cm/s（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠平均運動速度較WT小鼠減慢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.518，P＜0.05）。

2.2 α-syn A53T^+/+小鼠中腦SN區(qū)p-GluN2B 和pS129 α-syn蛋白表達變化

α-syn A53T^+/+小鼠和WT 小鼠中腦SN區(qū)p-GluN2B蛋白的表達水平分別為1.115±0.141和0.706±0.087（n=5），α-syn A53T^+/+小鼠SN區(qū)p-GluN2B蛋白的表達水平較WT小鼠明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.470，P＜0.05）。α-syn A53T^+/+小鼠和WT 小鼠SN區(qū)pS129 α-syn 蛋白的表達水平分別為1.277±0.219和0.433±0.094（n=5），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.533，P＜0.05）。

3 討 論

NMDA受體為谷氨酸門控離子通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，并在興奮性突觸傳遞中起著關(guān)鍵作用^[11]。NMDA受體共包含3種類型的亞基（GluN1～3），亞基結(jié)構(gòu)間具有高度同源性，均由氨基端、配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及羧基末端4個結(jié)構(gòu)域組成^[12-13]。越來越多的研究表明，在PD細胞模型和PD病人腦組織中，紋狀體和伏隔核中谷氨酸與NMDA受體結(jié)合顯著增加，而這可能會加速神經(jīng)元退化過程^[14-15]。有文獻報道，在亞急性1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）小鼠模型中，可以通過抑制mGlu2/3受體配體影響突觸后Fyn/NMDA受體的功能^[16]。最新的研究結(jié)果表明，在魚藤酮小鼠模型中，GluN2B在mGluR5介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷中發(fā)揮著重要作用^[17]。

上述研究揭示，在PD的進展過程中，NMDA受體介導(dǎo)的谷氨酸興奮性毒性發(fā)揮作用。本文研究結(jié)果顯示，12～15月齡α-syn A53T^+/+小鼠運動能力受損，與之前有關(guān)研究報道相吻合^[18]。本文結(jié)果還顯示，α-syn A53T^+/+小鼠SN區(qū)pS129 α-syn和p-GluN2B蛋白表達水平明顯升高，說明在SN區(qū)出現(xiàn)了α-syn聚集，從而可能過度激活Fyn使GluN2B亞基表達過磷酸化。有研究報道，F(xiàn)yn在Tyr1472處磷酸化GluN2B會抑制與網(wǎng)格蛋白接頭AP-2的結(jié)合，最終會抑制細胞表面含有GluN2B的NMDA受體的內(nèi)化^[19-20]。因此我們推測，當p-GluN2B增多時，由于Fyn活性增強使GluN2B內(nèi)化減少，導(dǎo)致大量Ca²⁺內(nèi)流，這可能成為神經(jīng)元損傷的重要原因。本研究為闡明NMDA受體參與PD發(fā)生發(fā)展的機制提供了思路，其具體機制還有待進一步探討。

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（本文編輯 馬偉平）