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    植物乳桿菌野生質(zhì)粒分析及其提取方法的優(yōu)化

    2018-12-10 06:35:16薩初拉蘇少鋒吳青海其布日王蘊(yùn)華劉紅葵
    畜牧與飼料科學(xué) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:條帶乳酸菌基因組

    薩初拉,蘇少鋒,吳青海,其布日,高 娃,王蘊(yùn)華,劉紅葵,呼 和

    (內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

    乳酸菌是已知的益生菌之一,目前被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵和食品工業(yè)及飼料中。隨著研究的深入,利用乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)功能性外源基因已成為研究熱點(diǎn)[1-3]。不同于真核生物表達(dá)系統(tǒng),細(xì)菌中存在大量的野生型質(zhì)粒,能夠表達(dá)和遺傳如代謝、抗性相關(guān)的基因,因此,挖掘高拷貝、穩(wěn)定復(fù)制的野生型質(zhì)粒元件和無質(zhì)粒受體菌是構(gòu)建細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵[4]。由于乳酸菌為革蘭氏陽性菌,且部分野生型質(zhì)粒拷貝數(shù)低,因此使用傳統(tǒng)堿裂解法或普通質(zhì)粒提取試劑盒提取效果并不理想[4-5]。目前,乳酸菌質(zhì)粒提取方法已有多個(gè)報(bào)道,但操作均過于復(fù)雜、周期長、毒性大、質(zhì)粒產(chǎn)量低且多數(shù)只適合對(duì)數(shù)期乳酸球菌[6-9],因此,該試驗(yàn)對(duì)比研究已報(bào)道的兩種常規(guī)方法和優(yōu)化后的方法,最終得到可應(yīng)用于平臺(tái)期植物乳桿菌的快速、高效的質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌質(zhì)粒,得到2個(gè)高拷貝質(zhì)粒和1個(gè)無質(zhì)粒受體菌,為進(jìn)一步開發(fā)和利用植物乳桿菌構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)試劑及材料

    1.1.1 菌株:菌株QZ21、QZ56和H18由筆者實(shí)驗(yàn)室分離自玉米秸稈青貯,并通過革蘭氏染色方法、APICH50試紙條、16S rDNA鑒定分類為植物乳桿菌屬。

    1.1.2 試劑:DNA分子量Marker購自寶生物工程(大連)有限公司;溶菌酶,酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基購自環(huán)凱微生物科技公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 質(zhì)粒提取方法:分別取100 μL QZ21、QZ56和H18植物乳桿菌菌液至10 mL MRS液體培養(yǎng)基,32℃,100 r/min培養(yǎng)過夜至平臺(tái)期。不同方法各取2 mL同一培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒提取對(duì)比分析。

    1.2.1.1 質(zhì)粒提取方法Ⅰ:將Klaenhammer等發(fā)表的方法進(jìn)行細(xì)微改動(dòng)。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌,12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入solutionⅠ(25%sucrose,30 mg/mL 溶菌酶)重懸,并置于 37 ℃,孵育 15 min;隨后加入 400 μL SolutionⅡ(3%SDS,0.2 mol/L NaOH),立即混勻,室溫孵育7 min 后; 加入 300 μL 乙酸鈉 (3 mol/L,pH 值4.8),立即混勻,12 000 r/min,離心 15 min;將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管,加入650 μL異丙醇, 混勻,12 000 r/min,4℃離心,15 min; 棄上清液,320 μL ddH2O 重懸沉淀,加入 200 μl 7.5 mol/L乙酸銨和0.5 mg/ml溴化乙錠溶液,混勻,再加入350 μL酚—氯仿溶液,混勻,12 000 r/min離心5 min;將得到的上清用乙醇沉淀,30 μL 1×TE溶解沉淀。

    1.2.1.2 質(zhì)粒提取方法Ⅱ:根據(jù)萬謙等[4]發(fā)表的方法。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入250 μL L-P1溶液 (20 mg/mL溶菌酶溶解于P1溶液中)重懸沉淀,37℃處理 30 min;12 000 r/min離心1 min,將上清液完全去除;其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。最終產(chǎn)物溶于 30 μL 1×EB。

    1.2.1.3 質(zhì)粒提取方法Ⅲ:取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入400 μL丙酮混勻;12 000 r/min離心1 min收集菌體。后續(xù)同方法Ⅱ。

    1.2.2 質(zhì)粒電泳:各取10 μL上述質(zhì)粒,加入2 μL 6×上樣緩沖液,混勻。使用含有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠,以3~4 V/cm進(jìn)行電泳檢測,紫外成像儀進(jìn)行拍照記錄。

    1.2.3 定量分析:各取2.5 μL上述質(zhì)粒,使用ddH2O稀釋200倍。使用貝克曼DU640紫外分光光度計(jì)對(duì)260、280 nm處的吸光值進(jìn)行分析,得到其核酸濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)粒提取結(jié)果

    該研究對(duì)比2種常規(guī)乳酸菌質(zhì)粒提取方法,通過提取青貯分離植物乳桿菌野生型質(zhì)粒后進(jìn)行電泳分析,由圖1可知,方法Ⅰ和Ⅱ均能夠檢測到QZ21和QZ56在2 000 bp上下有2條野生型質(zhì)粒條帶,且2種方法得到的條帶并無明顯差異。然而H18菌株除了染色體條帶以外并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶。為進(jìn)一步提高質(zhì)粒提取效率,該研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以簡便、毒性低的方法Ⅱ?yàn)榛A(chǔ),利用丙酮進(jìn)行前期處理平臺(tái)期植物乳桿菌形成方法Ⅲ,并與方法Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行了對(duì)比分析。如圖1所示,方法Ⅲ得到的QZ21和QZ56條帶相對(duì)于方法Ⅰ和Ⅱ更加清晰,說明丙酮前期處理能夠提高植物乳桿菌質(zhì)粒提取效率。但同樣方法Ⅲ提取H18質(zhì)粒后并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶,推測H18可能為無質(zhì)粒植物乳桿菌。

    2.2 質(zhì)粒濃度結(jié)果

    圖1 質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

    表1 紫外分光光度計(jì)分析質(zhì)粒濃度結(jié)果

    為進(jìn)一步量化質(zhì)粒提取結(jié)果,該試驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)測量相同體積質(zhì)粒提取物中的DNA含量。測得結(jié)果如表1所示,方法Ⅰ所得到的質(zhì)粒提取物中總的DNA含量明顯高于方法Ⅱ,但從電泳結(jié)果可知方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中基因組DNA的污染比例明顯高于方法Ⅱ,說明方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中純質(zhì)粒的含量較少。同樣改良后的方法Ⅲ的質(zhì)粒提取物中基因組DNA的比例也較高,可能由于丙酮前期處理后增加了細(xì)菌的裂解率,從而也提高了質(zhì)粒的提取率。由于常規(guī)質(zhì)粒提取過程中無法完全排除細(xì)菌基因組的污染,尤其是在革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)粒提取過程中,所以只能在保證質(zhì)粒提取量的前提下,盡量減少基因組的污染。

    3 討論

    質(zhì)粒提取效率受到細(xì)菌濃度、生長時(shí)期、提取方法、質(zhì)粒濃度和物種等多個(gè)因素的影響[10]。目前已有多個(gè)有效乳菌質(zhì)粒提取方法的報(bào)道[4-9]。其中多數(shù)均以乳酸菌為研究對(duì)象[4-5,7-8],而植物乳桿菌質(zhì)粒提取有效方法報(bào)道較少,且多數(shù)研究使用對(duì)數(shù)生長期的乳酸菌[4-8],然而獲得對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌時(shí)需要不斷監(jiān)測,且需要大量的培養(yǎng)物來達(dá)到所需的質(zhì)粒提取量。平臺(tái)期培養(yǎng)物通常可以從過細(xì)菌液培養(yǎng)物得到,并且菌液濃度也會(huì)最大,因此如果能利用平臺(tái)期植物乳桿菌進(jìn)行有效質(zhì)粒提取,則能夠節(jié)省人力的同時(shí),保障得到高濃度質(zhì)粒。植物乳桿菌野生型質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低,且平臺(tái)期細(xì)胞膜較厚,因此常規(guī)方法很難有效裂解平臺(tái)期植物乳桿菌細(xì)胞壁,需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn),從而獲得可廣泛應(yīng)用于平臺(tái)期植物乳桿菌的快速、高效質(zhì)粒提取方法。

    由上述電泳及紫外定量結(jié)果可知,所得到的質(zhì)粒濃度依照使用方法不同而不同。其中方法Ⅲ得到的DNA濃度最大,其次方法Ⅰ,而方法Ⅱ得到的DNA濃度最低。方法Ⅲ具有高效率的首要原因可能是在質(zhì)粒提取過程中使用了強(qiáng)通透劑——丙酮。這一過程大大增加了植物乳桿菌細(xì)胞壁通透性,從而為溶菌酶進(jìn)一步裂解細(xì)胞壁提供了良好的基礎(chǔ)[9]。利用方法Ⅰ檢測植物乳桿菌質(zhì)粒通常是可行的,但由于方法Ⅰ操作過程過于復(fù)雜,并且存在EB污染風(fēng)險(xiǎn),因此并不利于常規(guī)操作。方法Ⅱ應(yīng)用于乳酸球菌質(zhì)粒提取時(shí)具有很高的效率,但應(yīng)用于植物乳桿菌質(zhì)粒提取過程中時(shí)卻不盡人意。由此可知,并非所有乳酸球菌質(zhì)粒提取方法均適用于其他乳酸菌的質(zhì)粒提取,因此,需要依照不同的物種,對(duì)質(zhì)粒提取方法進(jìn)行優(yōu)化及改進(jìn)。方法Ⅰ得到的DNA總濃度雖然比方法Ⅱ得到的大,但依照電泳結(jié)果可知方法Ⅰ得到的質(zhì)粒提取物中基因組DNA污染較大,而方法Ⅱ使用了過柱純化方法,因此有效降低了基因組DNA的污染比例。

    該研究為建立快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法,在方法Ⅱ的基礎(chǔ)上增加了丙酮處理過程,從而提高了植物乳桿菌質(zhì)粒獲得率,建立了適合于平臺(tái)期植物乳桿菌快速、高效質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌QZ21、QZ56和H18的質(zhì)粒,得到2個(gè)高拷貝質(zhì)粒和1個(gè)無質(zhì)粒植物乳桿菌。其中高拷貝質(zhì)??梢愿脑鞛楸磉_(dá)載體,而無質(zhì)粒植物乳桿菌可以作為方便的受體菌株。

    由于乳酸菌的益生作用和食品領(lǐng)域應(yīng)用潛力,目前已被越來越多的研究團(tuán)隊(duì)所關(guān)注。如何開發(fā)利用乳酸菌作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、制藥、食品加工及飼料等領(lǐng)域的生物媒介是關(guān)鍵。其中乳酸菌工程菌的制備及相應(yīng)載體的構(gòu)建是基礎(chǔ),然而在此過程中,乳酸菌質(zhì)粒提取是重要的技術(shù)手段。乳酸球菌質(zhì)粒提取方法雖然已被廣泛報(bào)道,但植物乳酸桿菌質(zhì)粒的快速、高效提取方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。該試驗(yàn)中,通過對(duì)比分析不同試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化,得到了快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法,最終利用該方法獲得了構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)所需高拷貝質(zhì)粒和受體菌株,為構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

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