基于線粒體Cytb基因的擬裸蝗屬部分種類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

熊忠平 楊 晨 吳培福 柳 青

（1.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南省森林災(zāi)害與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.保山學(xué)院 資源環(huán)境學(xué)院，云南省高校滇西昆蟲資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 保山 678000）

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對昆蟲遺傳物質(zhì)的研究和分析，探討昆蟲各類群間的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳進(jìn)化、物種形成和分化等問題是當(dāng)前昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。線粒體基因（mitochondrial DNA，mtDNA）由于具有嚴(yán)格的母系遺傳、缺少基因重組以及較快的進(jìn)化速率等特點(diǎn)，而被廣泛用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳變異和分化以及近緣種、種下分類階元分子鑒定等方面[2-4]。其中，線粒體Cytb（Cytochrome b，Cytb）基因是目前昆蟲線粒體基因組13個編碼蛋白基因中結(jié)構(gòu)與功能研究得最清楚的基因之一[5-6]。Cytb基因進(jìn)化速率適中，較短的一個片段就能包含種下、種級、屬級乃至科級水平的系統(tǒng)信號，并且該基因中不同進(jìn)化速率的密碼子位點(diǎn)以及保守和突變的區(qū)域同時存在，使得該基因廣泛應(yīng)用于昆蟲系統(tǒng)進(jìn)化研究中[6-7]。有學(xué)者應(yīng)用Cytb基因和16S rRNA基因序列的聯(lián)合數(shù)據(jù)分析了北美田間蟋蟀Gryllus屬11種13個種群的系統(tǒng)演化關(guān)系，指出歐洲的Gryllus屬與北美洲的Gryllus屬間具有明顯的分枝，枝間分歧大于枝內(nèi)分歧[8]。也有學(xué)者通過對我國蝗總科8科10種蝗蟲的Cytb基因序列測定和構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，發(fā)現(xiàn)槌角蝗科Gomphoceridae、網(wǎng)翅蝗科Arcypteridae和劍角蝗科Acrididae 3科關(guān)系相對較近，它們是較為進(jìn)化的類群，這與傳統(tǒng)的分類觀點(diǎn)基本一致[9]；利用Cytb基因?qū)ξ覈叱峄瓤苐4種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究表明，14種蝗蟲可以明顯的分為4個支系[10]；對黃脛小車蝗Oedaleus infernalisSaussure線粒體Cytb研究表明，其種群間具有較高的遺傳多樣性，可能由于其遷移能力較強(qiáng)，弱化了其種群間的遺傳分化，使其種群間基因交流頻繁，地理距離并未對其種群間的基因交流產(chǎn)生影響，也不是造成其種群間遺傳分化的主導(dǎo)因素[11]；基于線粒體Cytb基因?qū)π陆哪牖哪菰獯罄炔煌乩矸N群的遺傳多樣性分析表明，意大利蝗群體穩(wěn)定，歷史上未出現(xiàn)群體擴(kuò)展，地理距離可能不是影響種群間遺傳距離的重要因素[3]。

蝗蟲是直翅目Othorptera蝗總科Acridoidea的統(tǒng)稱，也是昆蟲綱中的重要類群之一，許多種類是農(nóng)、林、園藝作物的重要害蟲[12]。目前，全世界已知直翅目有效種（亞種）為31 819種，我國直翅目物種記錄有3 633種[13]。擬裸蝗屬Conophymacris是蝗蟲的代表性類群，隸屬蝗總科斑腿蝗科Catantopidae，是Willemse于1933年建立[14]，屬模式種Conophymacris chinensis標(biāo)本采自于云南昆明[15]。擬裸蝗屬也是我國特有的短翅型蝗蟲類群，目前已知有10種，分別為中華擬裸蝗C.chinensisWillems、楚雄擬裸蝗C.chuxiongensisWang、錐尾擬裸蝗C.conicercaBi et Xia、云南擬裸蝗C.yunnanensisCheng、香格里拉擬裸蝗C.xianggelilaensisNiu et Zheng、黑股擬裸蝗C.nigrofemuraLiang、蒼山擬裸蝗C.cangshanensisZheng et Mao、綠擬裸蝗C.viridisZheng、九龍擬裸蝗C.jiulongensisZheng et Shi和四川擬裸蝗C.szechwanensisChang[15]，均分布在我國云南省中部及北部到四川西南部的橫斷山東部地區(qū)，并且大部分種類呈島嶼狀分布[16]。經(jīng)作者前期的觀察，擬裸蝗屬部分種間的差異并不明顯，部分種類的確定目前還存在著分歧，有必要進(jìn)一步厘定其屬內(nèi)的種間關(guān)系。因此，本研究利用線粒體Cytb基因測序分析擬裸蝗屬部分種類的遺傳特征，構(gòu)建該屬昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為該屬昆蟲的進(jìn)化及分類研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究野外調(diào)查期間共采集到擬裸蝗屬昆蟲6種，具體標(biāo)本采集信息見表1?；认x標(biāo)本的鑒定主要以鄭哲民《蝗蟲分類學(xué)》[17]為依據(jù)。

表1 六種擬裸蝗野外采集信息

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf AG Germany），微型離心機(jī)（BIO-RAD韓國分公司），PCR儀（BIO-RAD），微量移液槍（Eppendorf），DYY-Ⅲ-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像儀（GEL Japan），恒溫水浴振蕩搖床（天津奧特賽斯儀器有限公司），全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

動物組織DNA提取試劑盒（Animal tissue DNA Kit，Omega），蛋白酶K（Omega）、上樣緩沖液（雙染料6×loading buffer）、BM2000 DNA Marker、瓊脂糖（昆明碩陽科技有限公司）、50×TAE電泳緩沖母液（昆明碩陽科技有限公司）、核酸染料（昆明碩陽科技有限公司）、2×Power Taq PCR MasterMix（昆明碩陽科技有限公司）、酚:氯仿:異戊醇（25∶24∶1）（昆明碩陽科技有限公司）、氯仿:異戊醇（24∶1）（昆明碩陽科技有限公司）、SDS（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝗蟲基因組DNA提取

蝗蟲基因組DNA的提取按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。具體如下：

（1）用鑷子取一只擬裸蝗的胸部肌肉及腿部肌肉組織，加入到1.5 mL高溫滅菌的離心管中，用高溫滅菌的研磨棒將樣本研磨粉碎；

（2）用微量移液槍向離心管中再加入600 μL DNA提取緩沖液和10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），充分混勻混合，使蛋白酶K與組織細(xì)胞充分接觸；

（3）將離心管放置在預(yù)先加熱到65℃的恒溫水浴振蕩搖床上，震蕩消化3 h，每隔0.5 h人工震蕩混勻一次；

（4）將水浴消化的離心管上清液轉(zhuǎn)入到另一離心管中，加入600 μL已制備的酚:氯仿:異戊醇（25∶24∶1）充分混勻；

（5）將離心管置于高速冷凍離心機(jī)12 000 rpm/min離心10 min；

（6）將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至另一支1.5 mL離心管中，加入600 μL氯仿:異戊醇（24∶1）充分混勻；

（7）將離心管置于高速冷凍離心機(jī)12 000 rpm/min離心10 min；

（8）再將離心管中的上清液轉(zhuǎn)移至另一支1.5 mL離心管中，加入無水乙醇1 200 μL，輕柔混勻后置入冰箱（-20℃）中10 min；

（9）將離心管置于高速冷凍離心機(jī)12 500 rpm/min離心15 min，棄上清液（注意不要把DNA倒掉）；

（10）在離心管中加入220 μL Buffer BL，充分混勻，在70℃水浴鍋中孵化10 min；

（11）加入220 μL無水乙醇，在漩渦混合器中充分震蕩混勻后于微型離心機(jī)中離心；

（12）將試劑盒中的圓柱套在收集管上，把離心管中的上清液轉(zhuǎn)移到圓柱中，將收集管置于高速冷凍離心機(jī)8 000 rpm/min離心1 min，后倒掉收集管中液體；

（13）加入500 μL Buffer HB于圓柱中，將收集管置于高速冷凍離心機(jī)8 000 rpm/min離心1 min，后倒掉收集管中液體；

（14）加入650 μL DNA Wash Buffer于圓柱中，將收集管置于高速冷凍離心機(jī)8 000 rpm/min離心1 min，后倒掉收集管中液體；

（15）加入650 μL DNA Wash Buffer于圓柱中，將收集管置于高速冷凍離心機(jī)8 000 rpm/min離心1 min，后倒掉收集管中液體；

（16）將收集管置于高速冷凍離心機(jī)12 000 rpm/min離心3 min，后倒掉收集管中液體；

（17）圓柱下?lián)Q一個新的收集管，加入水浴鍋預(yù)熱70℃的Elution Buffer 50 μL，室溫放置3 min；

（18）將收集管置于高速冷凍離心機(jī)12 500 rpm/min離心3 min，收集管中即為所提DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

PCR引物根據(jù)NCBI GenBank中飛蝗及其他鞘翅目昆蟲的線粒體核苷酸數(shù)據(jù)，自行設(shè)計(jì)擴(kuò)增擬裸蝗屬線粒體Cytb基因的引物（見表2），預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小約為690 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表2 擬裸蝗屬6種蝗蟲Cytb基因PCR擴(kuò)增引物序列

PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括PCR mix 12.5 μL，上游引物CBJ 0.5 μL，下游引物CBN 0.5 μL，模板5 μL，滅菌水6.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，44℃退火35 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后于72℃下總延伸6 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以BM2000 DNA Marker作為參照標(biāo)準(zhǔn)，在120 V穩(wěn)定電壓條件下電泳30 min，凝膠成像并記錄結(jié)果。經(jīng)檢測合格的PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行樣品的純化和雙向測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用DnaMan 6.0軟件對所測序列進(jìn)行比對分析，采用DNAStar V7.1.0軟件MegAlign程序中的Clustal W方法來比對核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列，分析氨基酸組成。應(yīng)用MEGA（Version 6.0）軟件分析擬裸蝗屬昆蟲的堿基組成百分比、密碼子第三位G+C百分含量（GC3S），種間和種內(nèi)進(jìn)化距離，基因突變情況以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用DNAsp 5.0和MEGA（Version 6.0）程序來分析密碼子使用情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬裸蝗屬昆蟲線粒體Cytb基因的堿基組成

擬裸蝗屬6種蝗蟲線粒體Cytb基因序列中A、T、G、C堿基的平均含量分別為34.04%、39.32%、10.67%、15.97%；A+T平均含量（73.36%）明顯高于G+C平均含量（26.64%）。6種蝗蟲的堿基組成百分比基本一致，但亦存在差異；綠擬裸蝗和九龍擬裸蝗Cytb基因的T堿基平均含量高于其他各種，蒼山擬裸蝗的C堿基平均含量高于其他各種（見表3）。

表3 擬裸蝗屬6種蝗蟲Cytb基因的堿基組成特征

擬裸蝗屬6種蝗蟲的AT斜率和GC斜率均為負(fù)值，進(jìn)一步表明各種類堿基組成中A、G堿基含量低于T、C堿基含量；結(jié)合6種蝗蟲的AT斜率和GC斜率的絕對值，可以看出各種類中A堿基含量略低于T堿基含量，而G堿基含量明顯低于C堿基含量。此外，6種蝗蟲的GC3S平均含量存在一定的差異，其中香格里拉擬裸蝗GC3S平均含量（13.33%）最大，九龍擬裸蝗GC3S平均含量（10.83%）最小（見表3）。

2.2 擬裸蝗屬昆蟲線粒體Cytb基因的堿基替換

擬裸蝗屬6種蝗蟲的線粒體Cytb基因的堿基替換主要是發(fā)生堿基的顛換和轉(zhuǎn)換，且堿基替換大都發(fā)生在密碼子的第三位點(diǎn)。擬裸蝗屬6種蝗蟲整體的堿基顛換率為1.42，轉(zhuǎn)換率為22.15，表明轉(zhuǎn)換率均大于顛換率（見表4）。

表4 擬裸蝗屬6種蝗蟲Cytb基因的堿基替換

2.3 擬裸蝗屬昆蟲線粒體Cytb基因的種間進(jìn)化距離

擬裸蝗屬6種蝗蟲中，以云南擬裸蝗和綠擬裸蝗的種間進(jìn)化距離最大（0.068±0.014），九龍擬裸蝗和中華擬裸蝗的種間進(jìn)化距離最?。?.017±0.007）。整體而言，綠擬裸蝗與其他擬裸蝗屬種間的進(jìn)化距離均較大，但與香格里拉擬裸蝗種間進(jìn)化距離較?。ㄒ姳?）。

表5 擬裸蝗屬6種蝗蟲Cytb基因的種間進(jìn)化距離

2.4 擬裸蝗屬昆蟲線粒體Cytb基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以太白秦嶺蝗Qinlingacris taibaiensisYin et Chou和日本條螽Ducetia japonica（Thunberg）為外群，基于最大似然法（ML）和最大簡約法（MP）構(gòu)建擬裸蝗屬6種蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，最大似然法和最大簡約法兩種方法建樹結(jié)果基本一致，6種蝗蟲大體可以分為兩個分支，其中綠擬裸蝗、香格里拉擬裸蝗和蒼山擬裸蝗構(gòu)成一個大分支，中華擬裸蝗、九龍擬裸蝗和云南擬裸蝗3種構(gòu)成另外一個分支；綠擬裸蝗和香格里拉擬裸蝗聚在一個小分支上，說明兩者之間關(guān)系相對較近，與蒼山擬裸蝗的關(guān)系較遠(yuǎn)；云南擬裸蝗和九龍擬裸蝗聚在一個小分支上，同樣說明兩者具有較近的親緣關(guān)系，而與中華擬裸蝗關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖1）。

圖1 擬裸蝗屬6種蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

3 結(jié)論與討論

自1989年Kocher等設(shè)計(jì)了第一對脊椎動物Cytb基因部分片段的擴(kuò)增引物后，該基因立即被廣泛應(yīng)用于動物系統(tǒng)學(xué)研究中，目前被認(rèn)為是對動物種上和種下階元進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化研究最好的分子標(biāo)記之一[6，18]。本研究采用Cytb基因?qū)M裸蝗屬6種蝗蟲的遺傳特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，擬裸蝗屬6種蝗蟲的線粒體Cytb基因的堿基組成百分比基本一致，序列中A+T平均含量為73.36%，明顯高于G+C平均含量26.64%，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的AT偏向性，這一結(jié)果與前人對其他許多昆蟲的線粒體Cytb基因研究結(jié)果類似，普遍認(rèn)為在昆蟲的Cytb基因中，A+T含量為明顯高于G+C（A+T達(dá)到80%，G+C僅為20%），尤其是在密碼子第三位點(diǎn)，這種偏向更加明顯（A+T達(dá)到95%，G+C僅為5%）[19]；此結(jié)果也與前人等對我國蝗總科昆蟲的Cytb基因測序研究結(jié)果一致[8，20]，但與絹蝶（75.4%）[21]、果蠅（78.6%）[22]和意大利蜜蜂（84.9%）[23]相比則偏低。

擬裸蝗屬6種蝗蟲線粒體Cytb基因的堿基替換主要是發(fā)生顛換和轉(zhuǎn)換，且轉(zhuǎn)換率均大于顛換率，這與其他直翅目昆蟲相一致[9-10]。有研究認(rèn)為，與其他昆蟲相比，蝗總科昆蟲每個氨基酸密碼子第三位的A+T含量較高[9]，而較高的A+T含量增加了AT顛換的可能性，導(dǎo)致了氨基酸密碼子第3位點(diǎn)顛換速率的增加，進(jìn)而加速氨基酸的變異[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)的擬裸蝗屬6種蝗蟲Cytb基因堿基替換與A+T含量及氨基酸變異之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，6種蝗蟲間以云南擬裸蝗和綠擬裸蝗的種間進(jìn)化距離最大，九龍擬裸蝗和中華擬裸蝗的種間進(jìn)化距離最小。這與6種蝗蟲的野外分布格局較為吻合（表1），中華擬裸蝗是6種蝗蟲中分布最為廣泛的種類，在云南昆明、麗江、中甸及四川瀘定等地均有分布，云南擬裸蝗主要分布在云南個舊和昭通等地區(qū)，而綠擬裸蝗和九龍擬裸蝗分布范圍則十分狹窄[16]，加之?dāng)M裸蝗屬是典型的短翅型種類，無飛翔能力，其活動和擴(kuò)散區(qū)域十分有限，因此推測地理隔離可能是導(dǎo)致擬裸蝗屬6種蝗蟲種間進(jìn)化的主要因素。

擬裸蝗屬目前記載種類較少，但少數(shù)物種包括種下階元的歸隸仍具有一定的爭議，因此，及時厘清其屬內(nèi)種間系統(tǒng)關(guān)系就顯得十分必要。本研究表明，采用最大似然法和最大簡約法構(gòu)建的擬裸蝗屬6種蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，6種蝗蟲大體可以分為兩個分支，其中綠擬裸蝗、香格里拉擬裸蝗和蒼山擬裸蝗構(gòu)成一個大分支，中華擬裸蝗、九龍擬裸蝗和云南擬裸蝗3種構(gòu)成另外一個分支。易傳輝等采用支序生物地理學(xué)的方法研究了擬裸蝗屬8種蝗蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，認(rèn)為擬裸蝗屬不是一個嚴(yán)格的單系群，8種蝗蟲中四川擬裸蝗單獨(dú)聚為一支，與其他擬裸蝗的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；其余的7種擬裸蝗又分為兩個大的分支，其中云南擬裸蝗、中華擬裸蝗和綠擬裸蝗具有較近的親緣關(guān)系而聚為一支，錐尾擬裸蝗、蒼山擬裸蝗、楚雄擬裸蝗和黑股擬裸蝗4種具有較近的親緣關(guān)系而聚為一支[16]。這與本研究結(jié)果并不一致，本研究中綠擬裸蝗與蒼山擬裸蝗因具有較近的親緣關(guān)系而聚為一個大的分支。當(dāng)然，本研究涉及種類和方法與易傳輝等人的研究不盡相同，有待今后更全面的標(biāo)本采集，對該屬所有種類進(jìn)行線粒體基因組測序并結(jié)合外部形態(tài)特征進(jìn)一步確證該屬種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。