lncRNA NEAT1靶向miR-497-5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

于文昊 王海久（青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，西寧 810000）

胰腺癌是臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近30年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，且病死率較高，其早期癥狀不明顯，缺乏特異性篩查指標(biāo)，80%患者確診時(shí)多已是中晚期，僅5%左右患者進(jìn)行手術(shù)治療，但五年生存率不足5%［1-3］。因此，探尋胰腺癌新型生物治療靶標(biāo)已成為臨床研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一種反義RNA分子，不具有蛋白編碼能力，能與靶基因非編碼區(qū)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而發(fā)揮促癌或抑癌作用［4］。核富集轉(zhuǎn)錄體1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是lncRNAs家族成員之一，研究顯示，其對(duì)多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、肝癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等細(xì)胞生物學(xué)行為均具有調(diào)控作用［5-7］。miR-497-5p屬于miRNAs家族重要一員［8］，姜達(dá)偉等［9］研究顯示，過表達(dá)miR-497-5p能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。XIA等［10］研究顯示，NEAT1靶向下調(diào)miR-497-5p表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡。目前，有關(guān)NEAT1能否調(diào)控miR-497-5p影響胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究鮮有報(bào)道，因此本研究探討NEAT1與miR-497-5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等的影響，以期為臨床尋找胰腺癌新型生物治療靶點(diǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胰腺癌PANC-1細(xì)胞（bio-51676）購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基（3-2001）、蛋白提取試劑盒（BC3711-50T）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒（EF010-E）購(gòu)自美國(guó)艾美捷（武漢）科技有限公司；CCK-8試劑盒（CA1210-500T）、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（WK304）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RP1105-100T）、AceQqPCR SYBR Green Mix（ALH185）、Trizol Reagent核酸分離試劑（YT526）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（KFS303-HUV）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；靶向NEAT1的特異性siRNA（NEAT1-siRNA）及無關(guān)序列siRNA-NC由上海普邁生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；miR-497-5p-inhibitor及相應(yīng)陰性對(duì)照inhibitor-NC由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成；兔抗人細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原（MKI67 Affinity Purified Polyclonal Ab，Ki-67）（100130-MM21）、B淋巴 細(xì) 胞 瘤 基 因-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（FTB3598S）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（ATA25287）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin）抗體（貨號(hào)ACRO）、間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）（貨號(hào)K26866-PGZ）、N-鈣黏附蛋白（N-cadherin）抗體（貨號(hào)M00403-FCZ）、β-actin（ABP57456）多克隆抗體、山羊抗兔HRP（SE12-0.1）二抗均購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：BBD6220）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：ELx800）、熒光定量PCR儀（型號(hào)：C1000）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：CytoFLEX）購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取PANC-1細(xì)胞解凍，復(fù)蘇，置于含10%滅活胎牛血清（FBS）+DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液，無菌操作，細(xì)胞已長(zhǎng)滿（達(dá)80%～90%）時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及分組處理 取1.2.1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞接種于24孔板（2.5×104個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后，更換無FBS的培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并分組：①空白對(duì)照組（NG組）：細(xì)胞不做特殊處理；②陰性轉(zhuǎn)染組（siRNA-NC組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA轉(zhuǎn)染至PANC-1細(xì)胞中；③沉默NEAT1組（NEAT1-siRNA組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA轉(zhuǎn)染至PANC-1細(xì)胞中；④共轉(zhuǎn)染組（NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組）：采用LipofectamineTM3000將NEAT1-siRNA和miR-497-5p-inhibitor序列共轉(zhuǎn)染。用含10%滅活FBS+DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)NEAT1、miR-497-5p水平TRIzol法提取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的PANC-1細(xì)胞總RNA并測(cè)定濃度。以RNA為模板、PrimeScript RT reagent試劑盒說明書為操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。體系20μl：ULtraSYBR mixture（10.0μl）、模板cDNA（2.0μl）、上下游引物（各2.0μl）、去離子純化水（4.0μl）；93℃30 s、93℃5 s、65℃30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列詳見表1，由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算NEAT1、miR-497-5p水平相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞增殖能力取1.2.2各組培養(yǎng)48 h后的PANC-1細(xì)胞，消化，接種至24孔板（2.5×104個(gè)/孔），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)490 nm處各孔細(xì)胞光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞凋亡率取1.2.2各組培養(yǎng)48 h后的PANC-1細(xì)胞接種于24孔板中（2.5×105個(gè)/孔），按照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書處理細(xì)胞；加5μl碘化丙啶（PI）+5μl Annexin V-FITC混勻，染色，稀釋，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測(cè)增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志蛋白表達(dá)情況 以RIPA液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并檢測(cè)濃度及純度，行10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂牛奶封閉，加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及內(nèi)參β-actin，稀釋比均為1∶500，4℃過夜，清洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 數(shù)據(jù)庫（Starbase）顯示NEAT1與miR-497-5p核苷酸存在結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)miR-497-5p與NEAT1-3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增NEAT1-3'UTR序列中包含與miR-497-5p存在結(jié)合位點(diǎn)的片段，并插入到熒光素酶pGL4載體中，構(gòu)建NEAT1野生型質(zhì)粒（NEAT1-WT），并利用基因突變技術(shù)將個(gè)別結(jié)合位點(diǎn)序列突變，構(gòu)建突變型質(zhì)粒（NEAT1-MT）。使用LipofectamineTM3000將NEAT1-WT、NEAT1-MT分別與miR-497-5p-inhibitor-NC、miR-497-5p-inhibitor共轉(zhuǎn)染于PANC-1細(xì)胞，分別為miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT組、miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT組、miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-MT組，轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入RIPA裂解液（250μl）于室溫?fù)u床中搖晃15 min裂解細(xì)胞，收集裂解液，加入50μl熒光素酶檢測(cè)試劑Ⅱ，以自動(dòng)熒光素酶檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度A，之后加入Stop＆Glo，測(cè)定熒光強(qiáng)度B，以A/B表示熒光素酶相對(duì)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PANC-1細(xì)胞NEAT1、miR-497-5p水平比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞NEAT1水平顯著降低（P＜0.05），miR-497-5p水平顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細(xì)胞NEAT1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-497-5p水平顯著降低（P＜0.05，表2）。

表2 各 組PANC-1細(xì) 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

表2 各 組PANC-1細(xì) 胞NEAT1、miR-497-5p水 平 比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of NEAT1 and miR-497-5p levels in PANC-1 cells of each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P NEAT1/β-actin 0.99±0.15 1.00±0.15 0.55±0.081）2）0.53±0.071）2）271.020 0.000 miR-497-5p/U6 1.01±0.16 0.98±0.15 1.55±0.231）2）1.20±0.181）2）3）130.270 0.000

2.2 各組PANC-1細(xì)胞增殖情況比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細(xì)胞增殖抑制率顯著降低（P＜0.05，表3）。

表3 各組PANC-1細(xì)胞增殖情況比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

表3 各組PANC-1細(xì)胞增殖情況比較（±s，n=6）Tab.3 Comparison of PANC-1 cell proliferation in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor F P Cell proliferation inhibition rate（%）0.00 0.08±0.01 22.87±3.431）2）15.12±2.271）2）3）939.753 0.000

2.3 各組PANC-1細(xì)胞凋亡情況比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細(xì) 胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，圖1、表4）。

表4 各組PANC-1細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

表4 各組PANC-1細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n=6）Tab.4 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Apoptosis rate（%）15.69±2.35 17.01±2.55 40.05±6.061）2）27.88±4.191）2）3）558.343 0.000

圖1 各組PANC-1細(xì)胞凋亡情況比較Fig.1 Comparison of PANC-1 cell apoptosis in each group

2.4 各組PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與NEAT1-siRNA組比較，NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor組PANC-1細(xì)胞Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖2、表5）。

表5 各組PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

表5 各組PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.5 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expressions of PANC-1 cells in each group（±s，n=6）

Note：Compared with NG group，1）P＜0.05；compared with siRNA-NC group，2）P＜0.05；compared with NEAT1-siRNA group，3）P＜0.05.

Groups NG siRNA-NC NEAT1-siRNA NEAT1-siRNA+miR-497-5p-inhibitor FP Ki-67/β-actin 1.18±0.18 1.20±0.19 0.57±0.091）2）0.85±0.131）2）3）191.436 0.000 Bax/β-actin 0.33±0.04 0.35±0.05 0.97±0.161）2）0.67±0.111）2）3）699.870 0.000 Bcl-2/β-actin 0.95±0.14 0.96±0.15 0.30±0.051）2）0.71±0.111）2）3）305.653 0.000 E-cadherin/β-actin 0.55±0.08 0.58±0.09 1.17±0.251）2）0.87±0.131）2）3）273.400 0.000 N-cadherin/β-actin 1.21±0.18 1.19±0.19 0.52±0.081）2）0.79±0.121）2）3）240.613 0.000 Vimentin/β-actin 1.17±0.18 1.19±0.19 0.60±0.091）2）0.83±0.121）2）3）178.955 0.000

圖2 各組PANC-1細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較Fig.2 Comparison of proliferation，apoptosis and EMT related protein expression of PANC-1 cells in each group

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NEAT1對(duì)miR-497-5p的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn/degradomeRNA.php？source=mRNA）預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NEAT1與miR-497-5p基因序列存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NEAT1 WT的實(shí)驗(yàn)中，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組熒光素酶活性（1.37±0.21）顯著高于miR-497-5p-inhibitor-NC-NEAT1-WT組（1.03±0.15），（P＜0.05，圖4）。

圖3 NEAT1與miR-497-5p基因靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship between NEAT1 and miR-497-5p gene

圖4 熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of luciferase experiment

3 討論

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、侵襲性強(qiáng)特點(diǎn)，導(dǎo)致大多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期［11］。目前手術(shù)及化療手段是臨床治療胰腺癌的主要手段，但手術(shù)對(duì)于浸潤(rùn)程度深的患者有較大風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)療效有一定局限性，而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥性又限制了化療藥物的廣泛應(yīng)用及療效。

NEAT1是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)lncRNA，能夠參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，研究表明，其作為癌基因參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展［12］。郭春芳等［13］研究顯示，NEAT1在卵巢癌組織中異常高表達(dá)可能是卵巢癌潛 在 治 療 靶 點(diǎn)。WANG等［14］研 究 顯 示，過 表 達(dá)NEAT1顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲等。細(xì)胞增殖及凋亡失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，而EMT是指上皮細(xì)胞在正常生理及病理特征下向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變過程，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟［15-16］。其中上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin、Vimentin是EMT標(biāo)志蛋白，E-cadherin表達(dá)下調(diào)及N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)，胞間黏附作用減弱，進(jìn)一步促使癌細(xì)胞向周邊正常組織發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移［17-18］。本研究結(jié)果顯示，與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Bax、Ecadherin蛋白表達(dá)顯著升高，NEAT1水平及Ki-67、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低。與既往腫瘤研究中表達(dá)模式一致，說明沉默NEAT1表達(dá)可能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、EMT過程并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-497-5p是一種單鏈小分子RNA，位于腫瘤易突變區(qū)域人類染色體17q13.1，在多種腫瘤中異常低表達(dá)［19］。LIU等［20］研究顯示，miR-497可能通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果顯示，與NG組、siRNA-NC組比較，NEAT1-siRNA組PANC-1細(xì)胞miR-497-5p水平顯著升高，當(dāng)在轉(zhuǎn)染NEAT1-siRNA基礎(chǔ)上抑制miR-497-5p表達(dá)后，沉默NEAT1表達(dá)抑制PANC-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力減弱，說明沉默NEAT1表達(dá)可能通過上調(diào)miR-497-5p表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1可對(duì)miR-497-5p發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制凋亡［10］。本研究經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站得知NEAT1與miR-497-5p基因序列存在結(jié)合位點(diǎn)，且經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-497-5p-inhibitor-NEAT1-WT組熒光素酶活性顯著高于miR-497-5pinhibitor-NC-NEAT1-WT組。以上研究結(jié)果表明，沉默NEAT1表達(dá)可能靶向上調(diào)miR-497-5p表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及EMT過程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沉默lncRNA NEAT1表達(dá)能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及EMT過程，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能是通過靶向上調(diào)miR-497-5p實(shí)現(xiàn)的。然而胰腺癌發(fā)生發(fā)展是多因素的復(fù)雜過程，關(guān)于其細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)惡性行為進(jìn)展中l(wèi)ncRNA NEAT1對(duì)下游靶基因或相關(guān)通路的調(diào)控作用仍需深入探索。