干擾lncRNA DICER1-AS1通過調(diào)控miR-206抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移

高旦華 蔣紅芳 蔡漢炯（杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，杭州 311201）

近年來，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，非小細(xì)胞肺癌是肺癌的一大種類，隨著靶點(diǎn)及分子靶向藥物的不斷研發(fā)，分子靶向治療已成為晚期非小細(xì)胞肺癌患者一種重要治療手段［1-3］。研究表明lncRNA失調(diào)與肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，lncRNA已被證明是潛在的生物標(biāo)志物和癌癥診斷和治療的靶標(biāo)［4-5］。研究報(bào)道肺癌組織中l(wèi)ncRNA DICER1-AS1高表達(dá)可能是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［6］。lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，敲低lncRNA DICER1-AS1抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲［7］。然而lncRNA DICER1-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及機(jī)制還尚不清楚。miR-206定位于人類第6號(hào)染色體，大量研究顯示miR-206的表達(dá)失調(diào)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［8］。如miR-206在肺腺癌組織中低表達(dá)，miR-206過表達(dá)可以抑制A549的遷移和侵襲［9］。miR-206通過負(fù)向調(diào)節(jié)冠蛋白1C（coronin-1C，CORO1C）抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA DICER1-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及機(jī)制是否與miR-206有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院2018年1月至2020年1月收治的23例肺癌患者，通過手術(shù)取其癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，所有患者經(jīng)病理檢測(cè)確診為肺癌，且具有完整臨床病理資料，所有患者均知情同意。

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑A549細(xì)胞（貨號(hào)：CCL-185，美國(guó)ATCC）；RPMI1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：61870-127，美國(guó)Gibco公司）；Trizol試劑（貨號(hào)：9108-1）、熒光定量試劑盒（貨號(hào)：DRR420A，日本TaKaRa公司）；MTT試劑盒（貨號(hào)：1000936-5，上海賓智生物科技有限公司）；Transwell小室（貨號(hào)：354480，美國(guó)BD公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：D0010）、BCA試劑盒（貨號(hào)：PC0050，北京索萊寶科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號(hào)：R40010，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，將si-NC、si-lncRNA DICER1-AS1分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，記為si-NC組、si-lncRNA DICER1-AS1組；將si-lncRNA DICER1-AS1分 別 與anti-miR-NC、antimiR-206共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，記為si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組、si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)lncRNA DICER1-AS1和miR-206的表達(dá)水平 提取組織及細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系：2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5μl，補(bǔ)水至20μl；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，95℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；以GAPDH和U6為內(nèi)參，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，按試劑盒說明操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD×100%。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板，培養(yǎng)2周，分別用甲醇固定和吉姆薩染色，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞無血清培養(yǎng)12 h，Transwell小室上室添加200μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA DICER1-AS1和miR-206的靶向關(guān)系Starbase預(yù)測(cè)顯示lnc-RNA DICER1-AS1和miR-206存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建lncRNA DICER1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-lncRNA DICER1-AS1和MUT-lncRNA DICER1-AS1，將其分別與miR-NC和miR-206共轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。按照說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá) 提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入稀釋好的一抗（1∶500），4℃過夜，倒掉一抗，TBST洗膜，加入二抗（1∶3 000），室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL，暗室下顯影、定影。檢測(cè)蛋白條帶灰度值，蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織及各組處理A549中的表達(dá)及其靶向關(guān)系驗(yàn)證 肺癌組織中l(wèi)ncRNA DICER1-AS1表達(dá)水平高于癌旁組織，miR-206表達(dá)水平低于癌旁組織（P＜0.05，表1）。Starbase預(yù)測(cè)顯示lncRNA DICER1-AS1與miR-206存在結(jié)合位點(diǎn)（圖1A）。miR-206與WT-lncRNA DICER1-AS1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC與WT-lncRNA DICER1-AS1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（P＜0.05，圖1B）；與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組lncRNA DICER1-AS1表達(dá)水平降低，miR-206表達(dá)水平升高（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組miR-206表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖1C、D）。

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織中的表達(dá)（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

表1 lncRNA DICER1-AS1、miR-206在肺癌組織中的表達(dá)（±s，n=23）Tab.1 Expressions of lncRNA DICER1-AS1 and miR-206 in lung cancer tissues（±s，n=23）

Note：Compared with paracancer group，1）P＜0.05.

Groups Paracancer Lung cancer tissue tP lncRNA DICER1-AS1 1.01±0.13 3.21±0.251）37.443 0.000 miR-206 1.00±0.13 0.24±0.041）26.797 0.000

圖1 lncRNA DICER1-AS1靶向調(diào)控miR-206及miR-206表達(dá)的檢測(cè)Fig.1 Detection of miR-206 and miR-206 expression regulated by lncRNA DICER1-AS1

2.2 MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組處理A549增殖的影響 與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組細(xì)胞存活率降低，克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組 相 比，si-lncRNA DICER1-AS1+antimiR-206組細(xì)胞存活率升高，克隆形成數(shù)增加（P＜0.05，圖2）。

圖2 各組處理A549細(xì)胞存活率及克隆形成數(shù)的檢測(cè)Fig.2 Detection of survival rate and colony forming number of A549 cells in each group

2.3 Transwell檢測(cè)各組處理A549遷移的影響 與si-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1組遷移細(xì)胞數(shù)降低，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高（P＜0.05），與si-lncRNA DICER1-AS1組和si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-NC組相比，si-lncRNA DICER1-AS1+anti-miR-206組遷移細(xì)胞數(shù)增加，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平升高，E-cadherin表達(dá)水平降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組處理A549遷移細(xì)胞數(shù)目及Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Number of migration cells and expressions of Ki67，N-cadherin and E-cadherin protein in A549 treated by each group

3 討論

肺癌是當(dāng)今世界上病死率和發(fā)病率都非常高的惡性腫瘤，生物靶向藥物治療、手術(shù)治療和放療、化療是肺癌的重要治療手段，且其聯(lián)合治療效果較好。研究肺癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，尋找精準(zhǔn)的靶點(diǎn)對(duì)生物靶向藥物的研發(fā)具有重要意義［11-13］。研究報(bào)道lncRNA DICER1-AS1在骨肉瘤細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，lncRNA DICER1-AS1高表達(dá)與患者臨床分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與骨肉瘤患者的臨床預(yù)后不良也有關(guān)，可作為骨肉瘤的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物［14］。lncRNA DICER1-AS1在肺癌中也高表達(dá)［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺癌組織中l(wèi)ncRNA DICER1-AS1表達(dá)水平升高，與既往研究結(jié)果一致。為進(jìn)一步研究lncRNA DICER1-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，本實(shí)驗(yàn)將lncRNA DICER1-AS1干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率降低，克隆形成數(shù)降低，遷移細(xì)胞數(shù)降低，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高。Ki67是細(xì)胞增殖核抗原，與細(xì)胞增殖相關(guān)。研究表明Ki67與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，是老年肺腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素［15］。N-cadherin、E-cadherin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)標(biāo)志物，其表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究表明下調(diào)N-cadherin和上調(diào)E-cadherin的表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)表明干擾lncRNA DICER1-AS1可抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移。

研究表明miRNA參與肺癌的致癌性和生物學(xué)行為［17］。如上調(diào)miR-206表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［18］。且研究報(bào)道lncRNA MALAT1通過靶向miR-206和AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲［19］。lncRNA SNHG14通過miR-206/6-磷酸葡萄糖脫氫酶途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展［20］。以上結(jié)果表明miR-206高表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且lncRNA可通過調(diào)控miR-206影響癌細(xì)胞增殖、遷移。本實(shí)驗(yàn)通過在線軟件預(yù)測(cè)顯示，lncRNA DICER1-AS1與miR-206存在結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明lncRNA DICER1-AS1靶向調(diào)控miR-206的表達(dá)。干擾lncRNA DICER1-AS1表達(dá)，miR-206表達(dá)水平升高；且抑制miR-206表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA DICER1-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用。

綜上所述，干擾lncRNA DICER1-AS1可能通過上調(diào)miR-206表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移。