CTP介導(dǎo)的EGFRvⅢ肽疫苗誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答抑制腦膠質(zhì)瘤的研究①

許瓊冠 歐陽一彬 謝鎮(zhèn)明（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科二區(qū)，?？?571103）

膠質(zhì)瘤是腦內(nèi)最常見原發(fā)性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%［1-2］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類，膠質(zhì)瘤分為4級(jí)，其中1級(jí)和2級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，3級(jí)和4級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤，通常分級(jí)越高，預(yù)后越差。低級(jí)別膠質(zhì)瘤的十年生存率為47%，中位生存期為11.6年。對(duì)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤，3級(jí)膠質(zhì)瘤患者中位總生存期（overall survival，OS）約為3年，而4級(jí)膠質(zhì)瘤患者中位OS時(shí)間僅為15個(gè)月［3-5］。盡管過去幾十年已開發(fā)了多種癌癥療法，但很少有藥物被批準(zhǔn)用于膠質(zhì)瘤治療。

EGFRvⅢ（EGFR variantⅢ）是過表達(dá)的EGFR基因最常見選擇性剪接形式之一，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)率為15%～40%［6-7］。EGFRvⅢ突變是從外顯子2到7的選擇性剪接，導(dǎo)致胞外區(qū)6～273個(gè)氨基酸殘基缺失，并在融合連接處插入了1個(gè)新的甘氨酸，形成1個(gè)新的表位［8］。KLH與EGFRvⅢ新抗原的偶聯(lián)物命名為Rindopepimut（CDX-110），已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，作為晚期多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療性疫苗［9］。因此，直接基于新抗原表位的多肽疫苗是治療膠質(zhì)瘤的一種有吸引力的方案。但有研究報(bào)道，單肽免疫可能導(dǎo)致免疫耐受，而非激活抗腫瘤免疫應(yīng)答［10］。為克服多肽疫苗免疫耐受，增強(qiáng)其免疫原性，在臨床前和臨床試驗(yàn)中已對(duì)多種新抗原負(fù)載工具（如脂質(zhì)體和納米載體）進(jìn)行了評(píng)估［11-12］。但這些嘗試均基于內(nèi)吞依賴途徑，限制了抗原提呈細(xì)胞對(duì)新抗原的交叉呈遞作用［13］。胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（cytosolic transduction peptide，CTP）是一種11肽，可直接定位于胞漿［14］。研究表明，CTP-β-GAL融合蛋白在脾臟和淋巴結(jié)等免疫器官中有較高聚集趨勢(shì)，特異性分布于脾臟濾泡和邊緣區(qū)，提示CTP融合蛋白可能對(duì)包括抗原提呈細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞具有較高親和性［15］。本研究擬探索CTP修飾的EGFRvⅢ多肽疫苗是否可激活體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源16例腦膠質(zhì)瘤患者癌旁組織及35例腫瘤組織取自海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，所有組織獲取經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意?；颊呱鏀?shù)據(jù)由海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院對(duì)患者進(jìn)行跟蹤隨訪獲得。

1.1.2 主要試劑GL261-Luc細(xì)胞系購自北京科瑞思搏生物科技有限公司；脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自TBD公司；CD8+T淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自德國Miltenyi公司；GM-CSF、IL-4、IL-2購自美國R&D Systems；β-巰基乙醇購自美國Sigma公司；TRIzol試劑購自生工生物工程有限公司；SYBR1 Green PCR kits購自日本TaKaRa公司；TUNEL凋亡試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；抗CD8抗體購自美國eBioscience公司；抗CD-69流式抗體購自美國Biolegend公司；抗CD3免疫組化抗體購自美國Abcam公司；CFSE染色試劑購自美國Thermo Fisher公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡雌性BALB/c小鼠購自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：20200501 BZX300108。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)GL261-Luc細(xì)胞系采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)；6～8周齡雄性BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞加入GM-CSF（10 ng/ml）和IL-4（5 ng/ml）使其培養(yǎng)分化為樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），脾淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離淋巴細(xì)胞，按照說明書采用CD8+T淋巴細(xì)胞分離試劑盒對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行磁分離。分離的CD8+T淋巴細(xì)胞在添加10%FBS、IL-2（10 ng/ml）和β-巰基乙醇（50μmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.2 qPCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤患者腫瘤和癌旁組織EGFR表達(dá)TRIzol試劑提取患者組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)。PCR引物序列為EGFR F：5＇-TCCTTGGGAATTTGGAAATT-3＇，R：5＇-GGCATAGGAATTTTCGTAGTACAT-3＇；EGFRvⅢF：5'-GTATTGATCGGGAGAGCCG-3＇，R：5'-GTGGAGATCGCCACTGATG-3'；β-actin F：5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3'，R：5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性1 min，95℃變性5 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，共38個(gè) 循 環(huán)。2-ΔΔCt計(jì) 算EGFR和EGFRvⅢmRNA相對(duì)表達(dá)。

1.2.3 多肽疫苗制備CTP原始序列為YGRRARRRRRR。為提高CTP溶解度，采用G代替最初的Y，CTP最終序列為GGRRARRRRRRRK。EGFRvⅢ突變肽V2序列為L(zhǎng)EEKKGNYVVTDH。FITC通過ACP接頭置于偶聯(lián)肽N-末端。所有肽由上海吉爾多肽有限公司合成，經(jīng)高效液相色譜柱純化得到純度＞95%的多肽。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察CTP-V2胞質(zhì)定位情況提前12 h在24孔板中接種5×104個(gè)DCs，用不同濃度FITC標(biāo)記的多肽處理DCs，孵育時(shí)間分別為15 min、30 min和60 min。孵育結(jié)束后，PBS緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)負(fù)載多肽疫苗的DCs對(duì)CD8+T細(xì)胞的激活T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用1μmol/L CFSE與CD8+T細(xì)胞37℃孵育15 min，標(biāo)記CD8+T細(xì)胞。將負(fù)載多肽疫苗的DCs作為靶細(xì)胞，與CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞按2∶1效靶比孵育3 d，收集細(xì)胞，抗CD8抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE稀釋度。T細(xì)胞激活標(biāo)志物CD69檢測(cè)：將負(fù)載多肽疫苗的DCs作為靶細(xì)胞，與CD8+T細(xì)胞按2∶1效靶比孵育24 h，收集細(xì)胞，抗CD8及抗CD69抗體染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD69表達(dá)。

1.2.6 多肽疫苗的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn) 小鼠皮下注射1×105個(gè)GL261-Luc細(xì)胞，待腫瘤長(zhǎng)至80 mm3時(shí)隨機(jī)分為4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組5只。每7 d瘤周注射20 mg/kg多肽疫苗，每5 d測(cè)量腫瘤體積，第25天對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)行活體成像，處死小鼠后稱量腫瘤質(zhì)量。小鼠腫瘤體積=1/2長(zhǎng)×寬2。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn) 小鼠腫瘤組織經(jīng)甲醛固定，梯度乙醇脫水及石蠟包埋后，切片（5μm），脫蠟水合，檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，5%山羊血清室溫封閉1 h，加入抗CD3抗體（1∶100）4℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染，顯微鏡下觀察，Image Pro Plus軟件對(duì)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFRvⅢ是腦膠質(zhì)瘤的腫瘤標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)qRT-PCR檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤和癌旁組織總EGFR mRNA表達(dá)，結(jié)果表明：腫瘤組織EGFR mRNA水平顯著高于癌旁組織（圖1A，P＜0.001）。此外，EGFRvⅢ和野生型EGFR在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（R=0.58，圖1B）。腦膠質(zhì)瘤患者生存分析表明，EGFRvⅢ過表達(dá)或EGFR和EGFRvⅢ同時(shí)過表達(dá)顯示不良預(yù)后（圖1C）。

圖1 EGFRvⅢ是膠質(zhì)瘤的腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)Fig.1 EGFRvⅢis a tumor marker and prognostic indicator of glioma

2.2 CTP融合多肽可有效定位于DCs細(xì)胞質(zhì)EGFRvⅢ是EGFR胞外區(qū)缺失突變體，在N端6～273個(gè)氨基酸處形成1個(gè)新的LEEKKGNYVVTDH（V2）表位（圖2A）。將CTP與突變肽V2進(jìn)行偶聯(lián)，分析CTP-V2偶聯(lián)肽是否具有胞質(zhì)定位功能，倒置熒光顯微鏡結(jié)果表明，以10 mol/L CTP-V2與DCs共孵育30 min，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高（圖2D）。

圖2 DCs體外攝取CTP-V2的能力Fig.2 Validating uptake capability of CTP-V2 by DCs in vitro

2.3 負(fù)載CTP-V2的DCs可顯著激活CD8+T細(xì)胞將負(fù)載CTP-V2的DCs與CD8+T細(xì)胞共孵育（圖3A），CFSE稀釋實(shí)驗(yàn)表明，負(fù)載CTP-V2的DCs較負(fù)載V2的DCs可顯著增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞增殖（P＜0.000 1，圖3B、C）。此外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面激活標(biāo)志物CD69表達(dá)結(jié)果顯示，CTP-V2組CD8+T細(xì)胞表面CD69表達(dá)顯著高于V2組（P＜0.000 1，圖3D、E）。

圖3 負(fù)載CTP-V2的DCs刺激后CD8+T細(xì)胞激活能力Fig.3 Activated capacity of CD8+T cells after stimulated with DCs loaded with CTP-V2

2.4 CTP-V2顯著抑制小鼠腦膠質(zhì)移植瘤體內(nèi)增殖 建立小鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下移植瘤模型評(píng)估CTP-V2對(duì)腦膠質(zhì)瘤的抗腫瘤活性，活體成像結(jié)果顯示，CTP-V2治療組小鼠腫瘤顯著小于V2治療組（圖4A）。瘤體積監(jiān)測(cè)結(jié)果也顯示，CTP-V2治療組腫瘤生長(zhǎng)速度顯著低于V2治療組（P＜0.01，圖4B）。此外，瘤重結(jié)果也表明，CTP-V2治療組腫瘤質(zhì)量較V2治療組更?。≒＜0.01，圖4C）。

圖4 CTP-V2體內(nèi)抗腫瘤活性Fig.4 Anti-tumor activity of CTP-V2 in vivo

2.5 CTP-V2顯著增強(qiáng)T細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞凋亡 免疫組化結(jié)果顯示，CTP-V2治療組CD3+T細(xì)胞顯著多于V2治療組（P＜0.001，圖5A、B），說明CTPV2治療組腫瘤組織較V2治療組出現(xiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示：CTP-V2治療組TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯多于V2治療組（P＜0.000 1，圖5C、D）。

圖5 腫瘤免疫浸潤(rùn)和細(xì)胞凋亡Fig.5 Tumor immune infiltration and apoptosis

3 討論

近年多肽疫苗被用于刺激宿主免疫系統(tǒng)，激活對(duì)感染性或非感染性疾病的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其中新抗原疫苗在癌癥治療領(lǐng)域的潛力逐漸凸顯。哈佛大學(xué)的CATHERINE WU團(tuán)隊(duì)采用新抗原疫苗治療6例高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的黑色素瘤患者，其中4例治療后2年內(nèi)未復(fù)發(fā)，重新引起了研究者對(duì)腫瘤疫苗的興趣［16］。

EGFRvⅢ是典型的新抗原，編碼EGFRvⅢ的肽鏈?zhǔn)且环N理想的多肽疫苗，但單一的EGFRvⅢ無法引起顯著的抗腫瘤免疫應(yīng)答，需聯(lián)合佐劑或?qū)ζ溥M(jìn)行修飾［17-18］。近期研究表明，胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽修飾可能是增強(qiáng)治療性或預(yù)防性多肽疫苗免疫原性的有效策略，因?yàn)檫@種策略可介導(dǎo)多肽疫苗定位于抗原提呈細(xì)胞的胞漿中，利用交叉遞呈優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答［19］。

本研究中，EGFRvⅢ編碼的多肽疫苗與胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合，體外實(shí)驗(yàn)中，為研究抗原提呈細(xì)胞（如DCs）對(duì)疫苗的攝取，采用FITC標(biāo)記的疫苗示蹤DCs攝取抗原的效率，觀察到CTP-V2能有效被DCs攝取，且定位于胞質(zhì)。這種能夠直接定位于DCs細(xì)胞質(zhì)的性質(zhì)可更好地誘導(dǎo)交叉遞呈過程。課題組發(fā)現(xiàn)DC/CTP-V2組與CD8+T細(xì)胞共孵育后，T細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，CD69表達(dá)顯著升高，提示存在交叉遞呈。體內(nèi)研究中，CTP介導(dǎo)的多肽疫苗可顯著激活小鼠抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。

為達(dá)到臨床應(yīng)用效果，有研究采用患者DCs負(fù)載抗原，形成DCs疫苗，對(duì)患者進(jìn)行治療。與傳統(tǒng)的抗原負(fù)載工具，如PTDS和納米顆粒相比，CTP可將抗原肽直接攜帶到DCs胞漿，是一種安全的外源抗原遞送工具［20］。因此未來研究中，課題組將繼續(xù)探索DCs體外負(fù)載CTP-V2后對(duì)膠質(zhì)瘤的治療作用。

綜上，本研究報(bào)道了一種采用CTP介導(dǎo)的多肽疫苗誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，這種方法基于CTP強(qiáng)大的細(xì)胞質(zhì)定位能力，使外源抗原內(nèi)源化，從而誘導(dǎo)特異性和持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。EGFRvⅢ-GL261移植瘤模型中，CTP-V2可有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫以及表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤能力，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)的能力。因此，CTP-V2可能是治療膠質(zhì)瘤的一種新策略。