劉大朋 李 影 孫作乾 宋 濤 陳 敏
(棗莊科技職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系臨床醫(yī)學(xué)教研室,滕州 277599)
心肌細(xì)胞凋亡參與多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展,可導(dǎo)致心肌損傷,進(jìn)而引起炎癥反應(yīng),而炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)又會(huì)加劇心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α等的分泌,炎癥因子可通過(guò)直接或間接方式導(dǎo)致心肌損傷[3]。梔子是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材,主要含環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、黃酮、皂苷、多糖等化合物,具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[4]。梔子苷可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的心肌炎癥和心肌細(xì)胞凋亡[5]。梔 子 苷 可 通 過(guò) 上 調(diào)miR-145-5p表 達(dá) 保 護(hù)PC12細(xì)胞免受LPS引起的炎癥損傷[6]。梔子苷通過(guò)下調(diào)THRIL減輕心肌細(xì)胞的損傷和心臟功能障礙[7]。但梔子多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。miRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡,還參與炎癥免疫等[8]。研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào),可能與心肌損傷發(fā)生有關(guān)[9]。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老中miR-141-3p表達(dá)下降,可能通過(guò)調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE氧 化 應(yīng) 激 通 路 加 速 衰 老[10]。miR-141-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響尚不清楚,且梔子多糖影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的機(jī)制是否與miR-141-3p相關(guān)尚未可知。本研究旨在研究梔子多糖對(duì)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響及其機(jī)制是否與miR-141-3p有關(guān)。
1.1 材料 心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自深圳市百恩維生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LPS購(gòu)自北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司;梔子多糖購(gòu)自云南麥瑞科生物科技有限公司;ELISA試劑盒購(gòu)自上海繼錦化學(xué)科技有限公司;蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;Annexin V-FITC和PI試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司;熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Progema公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),將其分為對(duì)照組(Con)、LPS組、梔子多糖低、中、高濃度組;對(duì)照組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),LPS組細(xì)胞采用100 ng/ml LPS處理,梔子多糖低、中、高濃度組細(xì)胞分別采用終濃度為2.5、5、10μmol/L的梔子多糖和100 ng/ml LPS共同培養(yǎng)。
將anti-miR-NC、anti-miR-141-3p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF6分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞,再采用10μmol/L梔子多糖和100 ng/ml LPS處理,記為L(zhǎng)PS+Experiment-H+anti-miR-NC組、LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組、LPS+Experiment-H+pcDNA 3.1組、LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6組。
1.2.2 ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清,按照試劑盒說(shuō)明書操作。
1.2.3 Western blot檢 測(cè)Bax、KLF6蛋 白 表 達(dá)提取細(xì)胞總蛋白,定量后取60μg進(jìn)行SDSPAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉后分別加入一抗和二抗孵育,暗室中曝光顯影、定影,分析蛋白條帶灰度值,計(jì)算蛋白表達(dá)。
1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h,漂洗后加入10μl Annexin V-FITC和PI混勻,避光孵育10 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA后以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增,循環(huán)條件為95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。
1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-141-3p對(duì)KLF6的靶向調(diào)控作用 構(gòu)建KLF6的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-KLF6和MUT-KLF6,將其分別與miR-NC和miR-141-3p共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中,按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。將miR-NC、miR-141-3p、anti-miR-NC、anti-miR-141-3p分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中,按1.2.5檢測(cè)KLF6表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件分析,計(jì)量資料用±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與對(duì)照組相比,LPS組H9C2細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05),與LPS組相比,梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05,表1)。
表1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響(±s,n=9)Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2(±s,n=9)
表1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響(±s,n=9)Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2(±s,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.01;compared with LPS group,2)P<0.01.
Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP IL-1β/(pg·mg-1)56.85±7.01 394.71±32.521)283.36±31.202)215.62±24.302)103.63±14.012)293.671<0.001 TNF-α/(pg·mg-1)98.34±12.40 603.37±39.521)491.14±28.182)356.43±19.092)189.52±14.792)630.068<0.001
2.2 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,LPS組H9C2細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),與LPS組相比,梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細(xì)胞Bax表達(dá)顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05,圖1、表2)。
表2 梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2凋亡及Bax表達(dá)的影響(±s,n=9)Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
表2 梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2凋亡及Bax表達(dá)的影響(±s,n=9)Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.01;compared with LPS group,2)P<0.01.
Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP Bax 0.19±0.02 0.81±0.081)0.66±0.052)0.46±0.042)0.27±0.032)257.301<0.001 Apoptosis rate(%)8.02±0.57 26.91±1.951)21.24±1.822)16.74±1.452)13.00±0.792)235.402<0.001
圖1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)的影響Fig.1 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS
2.3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,LPS組H9C2細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著降低,KLF6表達(dá)顯著升高(P<0.05),與LPS組相比,梔子多糖高濃度組H9C2細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著升高,KLF6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,圖2、表3)。
表3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響(±s,n=9)Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
表3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響(±s,n=9)Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
Note:Compared with Con group,1)P<0.01;compared with LPS group,2)P<0.01.
Groups Con LPS LPS+Experiment-H F P miR-141-3p 0.99±0.08 0.18±0.021)0.72±0.062)441.606<0.001 KLF6 protein 0.36±0.03 0.81±0.061)0.43±0.042)259.525<0.001
圖2 KLF6蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of KLF6 protein
2.4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+anti-miR-NC組相比,LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組細(xì)胞H9C2中miR-141-3p表達(dá)顯著降低,IL-1β、TNF-α水平、Bax表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05,圖3、表4)。
表4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響(±s,n=9)Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
表4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響(±s,n=9)Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
Note:Compared with LPS+Experiment-H+anti-miR-NC group,1)P<0.01.
Groups LPS+Experiment-H+anti-miR-NC LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p tP miR-141-3p 0.71±0.06 0.20±0.021)24.191<0.001 IL-1β/(pg·mg-1)101.86±7.33 320.92±19.351)31.760<0.001 TNF-α/(pg·mg-1)190.14±13.09 523.56±22.661)38.223<0.001 Bax 0.28±0.03 0.66±0.051)19.551<0.001 Apoptosis rate(%)13.13±0.63 23.51±1.151)23.748<0.001
圖3 抑制miR-141-3p能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Inhibition of miR-141-3p reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS
2.5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+pcDNA3.1組 相 比,LPS+Experiment-H+pc-DNA3.1-KLF6組細(xì)胞H9C2KLF6表達(dá)顯著升高,IL-1β、TNF-α水平及Bax表達(dá)顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,表5、圖4)。
表5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響(±s,n=9)Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
表5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響(±s,n=9)Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS(±s,n=9)
Note:Compared with LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 group,1)P<0.01.
Groups LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6 t P KLF6 protein 0.42±0.04 0.75±0.051)15.461<0.001 IL-1β/(pg·mg-1)102.28±7.77 291.10±18.251)28.558<0.001 TNF-α/(pg·mg-1)189.33±12.96 507.33±20.731)39.022<0.001 Bax 0.27±0.03 0.59±0.061)14.311<0.001 Apoptosis rate(%)13.23±0.94 21.33±1.591)13.156<0.001
圖4 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Overexpression of KLF6 reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS
2.6 miR-141-3p靶 向調(diào) 控KLF6 TargetScan預(yù) 測(cè)顯示KLF6與miR-141-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,miR-141-3p與WT-KLF6共轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而miR-141-3p與MUT-KLF6共轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表6)。過(guò)表達(dá)miR-141-3p后KLF6表達(dá)降低,而抑制miR-141-3p表達(dá)后KLF6表達(dá)升高(P<0.05,圖5B、表7)。
圖5 miR-141-3p靶向調(diào)控KLF6Fig.5 miR-141-3p targeting regulates KLF6
表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s,n=9)Tab.6 Dual luciferase reporting experiment(±s,n=9)
表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s,n=9)Tab.6 Dual luciferase reporting experiment(±s,n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.01.
Groups miR-NC miR-141-3p tP WT-KLF6 1.02±0.10 0.31±0.031)20.402<0.001 MUT-KLF6 0.94±0.09 0.98±0.09 0.943 0.360
表7 miR-141-3p調(diào)控KLF6表達(dá)(±s,n=9)Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression(±s,n=9)
表7 miR-141-3p調(diào)控KLF6表達(dá)(±s,n=9)Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression(±s,n=9)
Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.01;compared with antimiR-NC group,2)P<0.01.
Groups miR-NC miR-141-3p anti-miR-NC anti-miR-141-3p FP KLF6 protein 0.40±0.04 0.12±0.011)0.37±0.04 0.94±0.092)376.500<0.001
中藥對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用[11]。炎癥因子和細(xì)胞凋亡均可導(dǎo)致心肌損傷,TNF-α、IL-6、IL-1β均屬于促炎因子,其水平升高會(huì)促發(fā)炎癥反應(yīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)梔子苷通過(guò)上調(diào)miR-145表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷[13]。梔子苷可通過(guò)激活Keap1/Nrf2通路抑制過(guò)氧化氫引起的心肌細(xì)胞氧化損傷[14]。梔子苷通過(guò)激活A(yù)MPKα抑制心肌ROS積累,從而阻斷NLRP3炎癥體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,并改善敗血癥小鼠心臟功能[15]。表明梔子苷對(duì)于心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究采用不同濃度梔子多糖處理LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞,結(jié)果顯示,IL-1β、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低,說(shuō)明梔子多糖可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌及細(xì)胞凋亡。提示梔子多糖也對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用。
研究報(bào)道m(xù)iR-141-3p過(guò)表達(dá)降低了慢性炎癥性疼痛小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6水平[16]。說(shuō)明miR-141-3p可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著降低,提示miR-141-3p參與心肌細(xì)胞損傷過(guò)程。為研究梔子多糖對(duì)心肌損傷的影響是否與miR-141-3p有關(guān),本研究先檢測(cè)梔子多糖處理后miR-141-3p表達(dá),結(jié)果顯示,miR-141-3p表達(dá)升高,而抑制miR-141-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了梔子多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的抑制作用。表明梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。
研究顯示,Kruppel樣因子(kruppel-like factor,KLF)6可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞纖維化[17]。KLF6通過(guò)抑制B細(xì)胞白血病/淋巴瘤6表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥[18]。miR-141-3p可通過(guò)靶向KLF12促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)miR-141-3p可能的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-141-3p與KLF6有結(jié)合位點(diǎn),且進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-141-3p可靶向調(diào)控KLF6表達(dá)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)梔子多糖可降低KLF6表達(dá),而過(guò)表達(dá)KLF6逆轉(zhuǎn)了梔子多糖對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子的抑制作用。提示梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p進(jìn)而調(diào)控KLF6表達(dá)影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。
綜上所述,梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p和KLF6抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放,對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。