梔子多糖調(diào)控miR-141-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響

劉大朋 李 影 孫作乾 宋 濤 陳 敏

（棗莊科技職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系臨床醫(yī)學(xué)教研室，滕州 277599）

心肌細(xì)胞凋亡參與多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展，可導(dǎo)致心肌損傷，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，而炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)又會(huì)加劇心肌細(xì)胞凋亡［1-2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、TNF-α等的分泌，炎癥因子可通過(guò)直接或間接方式導(dǎo)致心肌損傷［3］。梔子是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材，主要含環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油類、黃酮、皂苷、多糖等化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用［4］。梔子苷可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的心肌炎癥和心肌細(xì)胞凋亡［5］。梔 子 苷 可 通 過(guò) 上 調(diào)miR-145-5p表 達(dá) 保 護(hù)PC12細(xì)胞免受LPS引起的炎癥損傷［6］。梔子苷通過(guò)下調(diào)THRIL減輕心肌細(xì)胞的損傷和心臟功能障礙［7］。但梔子多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。miRNA不僅參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，還參與炎癥免疫等［8］。研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3p在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)，可能與心肌損傷發(fā)生有關(guān)［9］。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞衰老中miR-141-3p表達(dá)下降，可能通過(guò)調(diào)控Keap1-Nrf2/ARE氧 化 應(yīng) 激 通 路 加 速 衰 老［10］。miR-141-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響尚不清楚，且梔子多糖影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的機(jī)制是否與miR-141-3p相關(guān)尚未可知。本研究旨在研究梔子多糖對(duì)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響及其機(jī)制是否與miR-141-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自深圳市百恩維生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LPS購(gòu)自北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；梔子多糖購(gòu)自云南麥瑞科生物科技有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自上海繼錦化學(xué)科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC和PI試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Progema公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組H9C2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，將其分為對(duì)照組（Con）、LPS組、梔子多糖低、中、高濃度組；對(duì)照組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細(xì)胞采用100 ng/ml LPS處理，梔子多糖低、中、高濃度組細(xì)胞分別采用終濃度為2.5、5、10μmol/L的梔子多糖和100 ng/ml LPS共同培養(yǎng)。

將anti-miR-NC、anti-miR-141-3p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF6分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，再采用10μmol/L梔子多糖和100 ng/ml LPS處理，記為L(zhǎng)PS+Experiment-H+anti-miR-NC組、LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組、LPS+Experiment-H+pcDNA 3.1組、LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6組。

1.2.2 ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3 Western blot檢 測(cè)Bax、KLF6蛋 白 表 達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，定量后取60μg進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別加入一抗和二抗孵育，暗室中曝光顯影、定影，分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，漂洗后加入10μl Annexin V-FITC和PI混勻，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA后以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-141-3p對(duì)KLF6的靶向調(diào)控作用 構(gòu)建KLF6的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-KLF6和MUT-KLF6，將其分別與miR-NC和miR-141-3p共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。將miR-NC、miR-141-3p、anti-miR-NC、anti-miR-141-3p分別轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中，按1.2.5檢測(cè)KLF6表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組H9C2細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05，表1）。

表1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2（±s，n=9）

表1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of gardenia polysaccharide on inflammatory response in cells affected by LPS in H9C2（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP IL-1β/（pg·mg-1）56.85±7.01 394.71±32.521）283.36±31.202）215.62±24.302）103.63±14.012）293.671＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）98.34±12.40 603.37±39.521）491.14±28.182）356.43±19.092）189.52±14.792）630.068＜0.001

2.2 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組H9C2細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖低、中、高濃度組H9C2細(xì)胞Bax表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05，圖1、表2）。

表2 梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2凋亡及Bax表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表2 梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2凋亡及Bax表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-L LPS+Experiment-M LPS+Experiment-H FP Bax 0.19±0.02 0.81±0.081）0.66±0.052）0.46±0.042）0.27±0.032）257.301＜0.001 Apoptosis rate（%）8.02±0.57 26.91±1.951）21.24±1.822）16.74±1.452）13.00±0.792）235.402＜0.001

圖1 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)的影響Fig.1 Effects of gardenia polysaccharide on apoptosis and Bax expression of H9C2 cells induced by LPS

2.3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，LPS組H9C2細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著降低，KLF6表達(dá)顯著升高（P＜0.05），與LPS組相比，梔子多糖高濃度組H9C2細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著升高，KLF6表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，圖2、表3）。

表3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表3 梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞miR-141-3p、KLF6表達(dá)的影響（±s，n=9）Tab.3 Effects of gardenia polysaccharide on expressions of miR-141-3p and KLF6 in H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with Con group，1）P＜0.01；compared with LPS group，2）P＜0.01.

Groups Con LPS LPS+Experiment-H F P miR-141-3p 0.99±0.08 0.18±0.021）0.72±0.062）441.606＜0.001 KLF6 protein 0.36±0.03 0.81±0.061）0.43±0.042）259.525＜0.001

圖2 KLF6蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of KLF6 protein

2.4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+anti-miR-NC組相比，LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p組細(xì)胞H9C2中miR-141-3p表達(dá)顯著降低，IL-1β、TNF-α水平、Bax表達(dá)和細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05，圖3、表4）。

表4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表4 抑制miR-141-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-141-3p can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+Experiment-H+anti-miR-NC group，1）P＜0.01.

Groups LPS+Experiment-H+anti-miR-NC LPS+Experiment-H+anti-miR-141-3p tP miR-141-3p 0.71±0.06 0.20±0.021）24.191＜0.001 IL-1β/（pg·mg-1）101.86±7.33 320.92±19.351）31.760＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）190.14±13.09 523.56±22.661）38.223＜0.001 Bax 0.28±0.03 0.66±0.051）19.551＜0.001 Apoptosis rate（%）13.13±0.63 23.51±1.151）23.748＜0.001

圖3 抑制miR-141-3p能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Inhibition of miR-141-3p reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS

2.5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響 與LPS+Experiment-H+pcDNA3.1組 相 比，LPS+Experiment-H+pc-DNA3.1-KLF6組細(xì)胞H9C2KLF6表達(dá)顯著升高，IL-1β、TNF-α水平及Bax表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，表5、圖4）。

表5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

表5 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的細(xì)胞H9C2中炎癥反應(yīng)及凋亡的影響（±s，n=9）Tab.5 Overexpression of KLF6 can reverse effect of gardenia polysaccharide on inflammatory response and apoptosis of H9C2 cells induced by LPS（±s，n=9）

Note：Compared with LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 group，1）P＜0.01.

Groups LPS+Experiment-H+pcDNA3.1 LPS+Experiment-H+pcDNA3.1-KLF6 t P KLF6 protein 0.42±0.04 0.75±0.051）15.461＜0.001 IL-1β/（pg·mg-1）102.28±7.77 291.10±18.251）28.558＜0.001 TNF-α/（pg·mg-1）189.33±12.96 507.33±20.731）39.022＜0.001 Bax 0.27±0.03 0.59±0.061）14.311＜0.001 Apoptosis rate（%）13.23±0.94 21.33±1.591）13.156＜0.001

圖4 過(guò)表達(dá)KLF6能逆轉(zhuǎn)梔子多糖對(duì)LPS作用的H9C2細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Overexpression of KLF6 reverses effect of gardenia polysaccharide on apoptosis of H9C2 cells induced by LPS

2.6 miR-141-3p靶 向調(diào) 控KLF6 TargetScan預(yù) 測(cè)顯示KLF6與miR-141-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-141-3p與WT-KLF6共轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而miR-141-3p與MUT-KLF6共轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。過(guò)表達(dá)miR-141-3p后KLF6表達(dá)降低，而抑制miR-141-3p表達(dá)后KLF6表達(dá)升高（P＜0.05，圖5B、表7）。

圖5 miR-141-3p靶向調(diào)控KLF6Fig.5 miR-141-3p targeting regulates KLF6

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，n=9）Tab.6 Dual luciferase reporting experiment（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.01.

Groups miR-NC miR-141-3p tP WT-KLF6 1.02±0.10 0.31±0.031）20.402＜0.001 MUT-KLF6 0.94±0.09 0.98±0.09 0.943 0.360

表7 miR-141-3p調(diào)控KLF6表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression（±s，n=9）

表7 miR-141-3p調(diào)控KLF6表達(dá)（±s，n=9）Tab.7 miR-141-3p regulates KLF6 expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.01；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.01.

Groups miR-NC miR-141-3p anti-miR-NC anti-miR-141-3p FP KLF6 protein 0.40±0.04 0.12±0.011）0.37±0.04 0.94±0.092）376.500＜0.001

3 討論

中藥對(duì)心肌損傷具有保護(hù)作用［11］。炎癥因子和細(xì)胞凋亡均可導(dǎo)致心肌損傷，TNF-α、IL-6、IL-1β均屬于促炎因子，其水平升高會(huì)促發(fā)炎癥反應(yīng)［12］。研究發(fā)現(xiàn)梔子苷通過(guò)上調(diào)miR-145表達(dá)減輕LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷［13］。梔子苷可通過(guò)激活Keap1/Nrf2通路抑制過(guò)氧化氫引起的心肌細(xì)胞氧化損傷［14］。梔子苷通過(guò)激活A(yù)MPKα抑制心肌ROS積累，從而阻斷NLRP3炎癥體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并改善敗血癥小鼠心臟功能［15］。表明梔子苷對(duì)于心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究采用不同濃度梔子多糖處理LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，IL-1β、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低，說(shuō)明梔子多糖可抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子分泌及細(xì)胞凋亡。提示梔子多糖也對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用。

研究報(bào)道m(xù)iR-141-3p過(guò)表達(dá)降低了慢性炎癥性疼痛小鼠IL-1β、TNF-α和IL-6水平［16］。說(shuō)明miR-141-3p可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-141-3p表達(dá)顯著降低，提示miR-141-3p參與心肌細(xì)胞損傷過(guò)程。為研究梔子多糖對(duì)心肌損傷的影響是否與miR-141-3p有關(guān)，本研究先檢測(cè)梔子多糖處理后miR-141-3p表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-141-3p表達(dá)升高，而抑制miR-141-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了梔子多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的抑制作用。表明梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。

研究顯示，Kruppel樣因子（kruppel-like factor，KLF）6可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞纖維化［17］。KLF6通過(guò)抑制B細(xì)胞白血病/淋巴瘤6表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥［18］。miR-141-3p可通過(guò)靶向KLF12促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡［19］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)miR-141-3p可能的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p與KLF6有結(jié)合位點(diǎn)，且進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-141-3p可靶向調(diào)控KLF6表達(dá)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)梔子多糖可降低KLF6表達(dá)，而過(guò)表達(dá)KLF6逆轉(zhuǎn)了梔子多糖對(duì)LPS作用的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子的抑制作用。提示梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p進(jìn)而調(diào)控KLF6表達(dá)影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。

綜上所述，梔子多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-141-3p和KLF6抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放，對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。