千金子二萜醇調(diào)控TGF-β1/Smad通路影響腎癌小鼠TNF-α和IL-17表達(dá)①

蔣俊玲 趙俊峰 張嘉琪 周 磊 潘世杰 雷 震（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002）

腎癌是一種源于腎小管上皮的惡性腫瘤，2020年數(shù)據(jù)顯示，全球腎癌的新發(fā)病例占所有癌癥的4.1%，約2.4%患者死于腎癌［1］。腎癌治療以外科手術(shù)為主，綜合性治療為輔，一旦術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，免疫治療的治愈率僅為20%左右［2-4］。因此，尋找延長腎癌患者有效生存率的新藥迫在眉睫。中藥千金子（Euphorbiae semen）記載于多種醫(yī)書，是續(xù)隨子（Euphorbia lathyrismL，屬大戟科植物）成熟后干燥的種子，別名小巴豆和蒲薩豆，具有多種抗腫瘤和抗腫瘤多重耐藥的活性成分。大戟提取物可抑制多種腫瘤（肺癌和肝癌）細(xì)胞體外增殖和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，千金子二萜醇可抑制腎癌Renca細(xì)胞增殖（調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3及G0/G1期進(jìn)程）、轉(zhuǎn)移和侵襲，體內(nèi)實驗證實其可減緩腫瘤進(jìn)展、調(diào)控NF-κB活性抑制MMPs表達(dá)。

作為一種較為普遍的促炎細(xì)胞因子，近年多數(shù)腫瘤和炎癥中可檢測到TGF-β1含量升高，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［5］。TGF-β1/Smad可調(diào)控晚期癌癥進(jìn)展［6］。研究表明，TGF-β1可調(diào)控Smad2/3蛋白影響Foxp3（叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子）和RORγt（維甲酸受體相關(guān)孤兒受體）表達(dá)，從而調(diào)控Th17細(xì)胞影響其下游細(xì)胞因子TNF-α和IL-17表達(dá)［7］。高表達(dá)的IL-17和TNF-α等細(xì)胞因子可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和分期［8-9］；TNF-α可增加DNA損傷和突變、異常細(xì)胞增殖和新生血管形成、MMPs產(chǎn)生、血管通透性和滲漏性促進(jìn)癌癥進(jìn)展；IL-17可促進(jìn)MMPs釋放，通過誘導(dǎo)膠原和蛋白多糖蛋白水解變性，促進(jìn)免疫細(xì)胞向炎癥部位遷移，誘導(dǎo)VEGF釋放，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和組織入侵。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、IL-17和TNF-α等因子表達(dá)降低可抑制腎癌侵襲和轉(zhuǎn)移［10-12］。目前，國內(nèi)外關(guān)于千金子能否調(diào)控TGF-β1/Smad通路活性從而影響腎癌中TNF-α和IL-17表達(dá)尚未見報道。

因此，本研究通過構(gòu)建Renca腎癌小鼠模型，探討大戟提取物能否通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路活化影響TNF-α和IL-17表達(dá)，進(jìn)一步闡釋千金子的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 千金子二萜醇（四川維克奇生物科技有限公司）；RPMI1640、FBS、0.25%胰酶-EDTA和Phosphate Buffered Saline（以色列BI公司）；青-鏈霉素混合液、二甲基亞砜、普通組織RIPA裂解液和ECL顯影液（索萊寶公司）；PEG-300和SB-431542（Med Chem Express公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；p-Smad2/p-Smad 3 Rabbit mAb（CST公 司）；Smad2/3 Rabbit pAb（ABclonal公司）；內(nèi)參蛋白GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（武漢三鷹有限公司）；TNF-α和IL-17A ELISA試劑盒（聯(lián)科生物）。

1.1.2 細(xì)胞及實驗動物Renca細(xì)胞（北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；4～8周齡雄性SPF級BALB/c小鼠（北京斯貝福生物技術(shù)有限公司），許可證號：SCXK（京）2019-0010，體質(zhì)量18～22 g，于25℃、12 h光照/12 h黑暗實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲食飲水。動物實驗經(jīng)河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Renca細(xì)胞培養(yǎng) 將完全培養(yǎng)基中的Renca細(xì)胞恒溫培養(yǎng)至85%飽和，胰蛋白酶消化，離心，制備1×107個/ml細(xì)胞懸液，Countstar計數(shù)。

1.2.2 小鼠腎癌模型構(gòu)建及分組給藥 小鼠腋窩（右前肢）皮下注射細(xì)胞懸液（0.2 ml/只），隨機分為模型組、實驗組和SB-431542組，10只/組，密切觀察腫瘤生長情況，長至5 mm約14 d，各組間瘤塊生長無明顯差異時開始給予藥物干預(yù)。實驗組（千金子二萜醇組）灌胃給予20 mg/kg千金子二萜醇溶液；模型組灌胃給予等量生理鹽水；SB-431542組（TGF-β1/Smad通路抑制劑組）給藥17 d開始連續(xù)腹腔注射10 mg/kg SB-431542溶液3 d，共給藥19 d，每3 d測量小鼠體質(zhì)量及瘤塊長、短徑。給藥結(jié)束后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，眼科彎頭鑷摘除小鼠眼球后取血，置于2 ml EP管離心，取上清，低溫保存，小心剝離小鼠皮下移植瘤瘤塊于液氮中冷凍，分離各組小鼠完整脾臟并稱重。

1.2.3 脾臟指數(shù)計算 計算各組腎癌移植瘤小鼠脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)（%）=脾臟重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）×100%，并進(jìn)行分析。

1.2.4 Western blot檢測瘤塊TGF-β1/Smad通路表達(dá) 取米粒大小的瘤塊放入蛋白裂解液中提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉封閉，加入Smad2/3和p-Smad2/3及GAPDH一抗4℃搖床孵育過夜，清洗后加入山羊抗兔抗體孵育1 h，ECL顯色，定量分析條帶灰度值。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α和IL-17水平 將ELISA試劑盒及實驗物品平衡至室溫，按說明書操作，提前配備所需試劑，樣本孔里預(yù)先加入檢測緩沖液（×10倍稀釋為×1倍）80μl，加入20μl血清（室溫）振蕩混勻，測定小鼠血清450 nm、570 nm處OD值，按照實驗最終得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線及OD值進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 千金子二萜醇對腎癌移植瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響 如圖1所示，給藥19 d后，實驗組和SB-431542組小鼠脾臟指數(shù)明顯低于模型組（4.71±1.11，4.45±0.34vs6.29±2.40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.626，P＜0.05）。

圖1 各組腎癌移植瘤小鼠脾臟指數(shù)Fig.1 SI of RCC transplanted mice in each group

2.2 千金子二萜醇對腎癌Renca移植瘤小鼠TGF-β1/Smad信號通路蛋白表達(dá)的影響 給藥19 d后，實驗組與SB-431542組小鼠Smad2/3蛋白表達(dá)明顯高于模型組（2.57±0.24，2.73±0.57vs1.56±0.29，F(xiàn)=7.858，P＜0.05），實 驗 組 與SB-431542組 小 鼠p-Smad2/3蛋白表達(dá)明顯低于模型組（0.32±0.08，0.22±0.09vs0.71±0.04，F(xiàn)=37.61，P＜0.01，圖2）。

圖2 Western blot檢測小鼠瘤塊中TGF-β1/Smad通路激活情況Fig.2 Activation of TGF-β1/Smad pathway in mouse tumor mass detected by Western blot

2.3 千金子二萜醇對腎癌小鼠血清TNF-α和IL-17表達(dá)的影響 給藥19 d后，與模型組相比，實驗組和SB-431542組小鼠血清TNF-α和IL-17含量降低（P＜0.01），但后兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組腎癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表達(dá)（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

表1 各組腎癌移植瘤小鼠血清TNF-α和IL-17表達(dá)（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Expressions of TNF-αand IL-17 in serum of RCC transplanted mice in each group（±s，n=8，pg/ml）

Note：1）P＜0.01 vs model group.

Groups Model Experimental SB-431542 F P TNF-α 31.23±1.56 22.95±0.601）21.82±1.35 137.15＜0.01 IL-17 8.52±1.16 5.87±0.721）5.19±0.67 32.20＜0.01

3 討論

千金子作為我國傳統(tǒng)大戟屬中草藥，性溫味辛，毒性較小，調(diào)理大腸、肝和腎，主祛水消腫和破血消癥，在痰飲、積滯脹滿、水腫和大小便不暢等疾病治療中發(fā)揮作用。多位學(xué)者研究其化學(xué)成分及藥理作用發(fā)現(xiàn)，千金子中的二萜類、甾醇及香豆素等成分具有一定抗腫瘤、致瀉、抗炎鎮(zhèn)痛和美白等作用，其中二萜類化合物起主要作用。陶麗等［13］發(fā)現(xiàn)，千金子二萜醇及其衍生物對NSCLC有一定抗癌療效，在其母體醇環(huán)中引入酯類可增強抗腫瘤活性。ZHANG等［14］研究發(fā)現(xiàn)，千金子二萜類化合物能夠逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞系中ABCB1（一種編碼p-糖蛋白的基因）介導(dǎo)的多重耐藥。近年本課題組通過研究千金子二萜醇對Renca細(xì)胞的作用機制發(fā)現(xiàn)，千金子二萜醇能夠抑制Renca細(xì)胞增殖過程中從G0期過渡到G1期、增加Bax和Caspase-3兩個促凋亡蛋白表達(dá)從而加速腫瘤細(xì)胞凋亡，同時降低Bcl-2表達(dá)加速細(xì)胞凋亡，并在一定程度抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移，深入研究發(fā)現(xiàn)，腎癌小鼠模型中NF-κB激活也可被抑制［15］。本研究進(jìn)一步驗證了千金子二萜醇對腎癌小鼠TGF-β1/Smad通路的影響及抗腫瘤機制。

近年腎癌被認(rèn)為是一種免疫原性腫瘤，從最初IL-6和IL-8等細(xì)胞因子的非特異性免疫治療到針對VEGF的靶向治療，又轉(zhuǎn)向新的免疫治療［3，16-19］。研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等免疫抑制細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠調(diào)控腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），可一定程度介導(dǎo)免疫功能無法精準(zhǔn)調(diào)節(jié)的紊亂。TME由腫瘤血管系統(tǒng)、淋巴細(xì)胞及炎癥微環(huán)境等組成，腫瘤進(jìn)展與其中的IL-17和TNF-α等因子相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路可被TNF-α和IL-17等因子影響進(jìn)而調(diào)控腫瘤中PD-L1及MMP-2/9蛋白表達(dá)，并影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［15，20］。TNF-α是一種可促炎的多能細(xì)胞因子。IL-17A（多數(shù)指IL-17）是Th17細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，與IL-17F以同型二聚體或異型二聚體形式分泌，IL-17可與其二聚體受體（異源性）IL-17RA和IL-17RC結(jié)合，進(jìn)一步激活A(yù)ct1，而后TRAF6蛋白發(fā)生激活從而調(diào)控MAPK和NF-κB等通路加速腫瘤進(jìn)展。TGF-β1可促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖分化，加強TNF-α和IL-17表達(dá)，且這兩種細(xì)胞因子在腎癌中呈高表達(dá)，與腎癌進(jìn)展和分級有關(guān)。TGF-β1與其Ⅲ型受體（TβRⅢ）和TβRⅡ結(jié)合，進(jìn)而募集TβRⅠ二聚體形成四聚體復(fù)合物（異源性），受體構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致TβRⅡ發(fā)生自身磷酸化，激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ可促使Smad2/3蛋白向其磷酸化形式轉(zhuǎn)變，即p-Smad2/3，經(jīng)過其他因子的輔助作用，Smad4與p-Smad2/3結(jié)合形成異源性復(fù)合物，在一系列因子作用下到達(dá)細(xì)胞核，上調(diào)Foxp3和RORγt表達(dá)而增強Th17細(xì)胞增殖分化，分泌IL-17和TNF-α［21-24］。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)腎癌小鼠TGF-β1/Smad通路激活受千金子二萜醇調(diào)控，進(jìn)而降低血清TNF-α和IL-17含量，脾臟指數(shù)亦有所降低。由于缺乏具體基因?qū)用娣治黾笆苊庖呒?xì)胞檢測手段所限，本研究僅初步探討了千金子二萜醇對腎癌的抑制機制，仍需進(jìn)一步完善相關(guān)作用機制和具體靶點，為中醫(yī)藥治療腎癌提供新的思路。