圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的改善作用及機(jī)制探討①

楊舒鈞 梁紅亮 滕 俊 魏 娜 謝 銳（三六三醫(yī)院消化內(nèi)科，成都 610041）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是以腸道炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)、腸黏膜受損為主要表現(xiàn)的病變，疾病發(fā)展后期會(huì)波及大段腸腔，引發(fā)中毒性結(jié)腸炎、腸外并發(fā)癥，甚至結(jié)腸癌，嚴(yán)重威脅人們的生命［1-2］。目前，對(duì)于UC的治療藥物主要以糖皮質(zhì)激素、生物制劑及免疫抑制劑為主，具有一定的療效，但其毒副作用不容忽視。研究顯示天然有效成分對(duì)治療UC效果明顯、副作用小，如芍藥苷、原花青素、白藜蘆醇等。因此，尋找安全有效的天然藥物對(duì)治療UC具有重要意義。

圣草酚又名北美圣草素（eriodictyol），是一種天然的類(lèi)黃酮化合物，廣泛存在于藥用植物、水果蔬菜中，具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性［3-4］。BAI等［5］的報(bào)道指出，圣草酚可抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)積累、氧化應(yīng)激和人類(lèi)腎小球系膜細(xì)胞的炎癥。王茹等［6］研究顯示，圣草酚對(duì)小鼠結(jié)腸炎可以起到緩解作用，可能與激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化、抗炎作用有關(guān)。但圣草酚對(duì)UC的具體作用機(jī)制仍不清楚，因此，本研究擬建立葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的大鼠UC模型，探討圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只雄性SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南（GB/T 35892-2018）》原則與要求。

1.1.2 藥物與試劑DSS購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶試劑盒（iNOS）、TNF-α試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-10試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅染色（HE）試劑購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；Bax、Bcl-2、p65等相關(guān)抗體購(gòu)自上海艾博抗有限公司。

1.1.3 主要儀器DNM-9602酶標(biāo)分析儀，DG3090自動(dòng)洗板機(jī)購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司；TGL16M高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；BD-SW3002生物顯微鏡購(gòu)自深圳博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司；Biosafer-20TA純水儀購(gòu)自南京賽飛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 將50只雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：健康對(duì)照組、模型組（DSS）及3個(gè)不同濃度劑量組（DSS+圣草酚10、20、40 mg/kg）。除健康對(duì)照組飲用純凈水外，其余各組大鼠飲用4%DSS溶液7 d，繼續(xù)飲用純凈水3 d后，3個(gè)劑量組給予相應(yīng)濃度藥物，而健康對(duì)照組與模型組給予相同劑量的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），1次/d，連續(xù)灌胃10 d。末次給藥后，采用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，用采血針腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液待測(cè)；取各組大鼠肛門(mén)2 cm以上的全部結(jié)腸，將結(jié)腸腸管縱行剖開(kāi)，取部分結(jié)腸組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，剩余結(jié)腸用生理鹽水處理，制備10%的結(jié)腸勻漿，置于-80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（DAI）在實(shí)驗(yàn)期間，每日稱(chēng)大鼠體質(zhì)量、觀察大鼠糞便性狀、檢測(cè)大鼠糞便隱血情況，并記錄結(jié)果，參照文獻(xiàn)［7］根據(jù)表1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行疾病指數(shù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算公式：DAI=（體質(zhì)量下降指數(shù)+糞便性狀+糞便隱血）/3。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Disease activity index scoring criteria

1.2.3 評(píng)估結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）剖取大鼠肛門(mén)至盲腸末端的結(jié)腸段，清理腸系膜及粘連組織，沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，冰生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，平鋪于濾紙上，參照文獻(xiàn)［8］按表2進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷程度評(píng)分。

婦產(chǎn)科急腹癥常見(jiàn)于宮外孕、黃體破裂以及卵巢囊腫蒂扭轉(zhuǎn)等。具體的診斷要結(jié)合其病史以及尿妊娠試驗(yàn)進(jìn)行鑒別。

表2 結(jié)腸膜損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Colonic membrane injury score criteria

1.2.4 HE染色觀察病理形態(tài) 取蠟塊包埋的結(jié)腸組織，組織切片機(jī)切片。經(jīng)水浴展平、置載玻片烘干、二甲苯脫蠟后，進(jìn)行HE染色，封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HS）石蠟切片常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察評(píng)分。參照文獻(xiàn)［9］按照表3進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分。

表3 結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Colon histopathology score criteria

1.2.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子的含量 取1.2.1制備的血清，分別按照iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-10試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 Western blot檢測(cè)炎癥因子相關(guān)蛋白的表達(dá) 取1.2.1制備的結(jié)腸勻漿液，加入RIPA裂解液，冰浴30 min后，離心取上清，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性，獲得上樣樣本。采用SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行脫脂奶粉封閉后，分別加入iNOS、IL-10相關(guān)一抗，在4℃下孵育過(guò)夜，TBST沖洗，加入二抗孵育1 h，TBST沖洗3次，ECL顯影后分析灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 TUNEL觀察結(jié)腸組織凋亡情況 根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相應(yīng)操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織凋亡細(xì)胞并拍攝。

1.2.9 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 采用Bax、Bcl-2、Caspase 3等相關(guān)一抗，根據(jù)1.2.7的操作進(jìn)行。

1.2.10 試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平 采用SOD、MDA、LDH、GSH試劑盒，按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.11 Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織中AKT/NF-κB通路的相關(guān)蛋白表達(dá) 采用AKT、P65等相關(guān)一抗，根據(jù)1.2.7進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組數(shù)據(jù)用單因素方差分析（One-Way ANOVA），計(jì)量資料用±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎損傷程度的影響 健康對(duì)照組大鼠無(wú)體質(zhì)量降低、糞便松軟、便血等癥狀，毛發(fā)光亮，狀態(tài)良好；結(jié)腸黏膜無(wú)粘連、潰瘍等癥狀；大鼠黏膜上皮完整，表面光滑，細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，黏膜下層、肌層、漿膜層結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠精神萎靡、活動(dòng)量和進(jìn)食量減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢甚至減輕，大便松散，逐漸出現(xiàn)腹瀉、便血的癥狀；大鼠結(jié)腸與周?chē)M織有不同程度粘連，腸腔擴(kuò)張，縱行剖開(kāi)多見(jiàn)潰瘍；大鼠黏膜上皮壞死脫落，大面積潰瘍形成，腺上皮細(xì)胞增生，黏膜層、黏膜下層充血水腫，大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

除DSS+圣草酚10 mg/kg組狀態(tài)與模型組相似外，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組大鼠結(jié)腸無(wú)粘連及腸腔擴(kuò)張，縱行剖開(kāi)后少見(jiàn)潰瘍，局部充血，黏膜下層輕度充血水腫，見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯潰瘍（圖1A），狀態(tài)均優(yōu)于模型組，有不同程度的改善。統(tǒng)計(jì)DAI、結(jié)腸黏膜CMDI、結(jié)腸組織HS。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，模型組DAI、CMDI、HS評(píng)分明顯升高；與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組無(wú)顯著性差異，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組DAI、CMDI、HS評(píng)分均明顯降低，且具有一定的劑量依賴(lài)性（圖1B～D）。

圖1 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC損傷程度的影響Fig.1 Effect of eriodictyol on damage degree of DSSinduced UC rats

2.2 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC炎癥因子水平的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組相比，模型組促炎因子iNOS、TNF-α、IL-1β含量明顯升高，抗炎因子IL-10含量明顯降低；與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組iNOS、TNF-α、IL-1β含量均明顯降低，IL-10含量明顯升高，且具有一定的劑量依賴(lài)性（圖2）。

圖2 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC炎癥因子水平的影響Fig.2 Effect of eriodictyol on levels of inflammatory factors in DSS-induced UC rats

2.3 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC凋亡水平的影響TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示：細(xì)胞核中有棕黃色著染者為凋亡細(xì)胞，被染上棕色的細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，肝細(xì)胞變小、變圓、核固縮；而正常細(xì)胞的胞核不著染。健康對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中凋亡細(xì)胞數(shù)目極少，細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠凋亡細(xì)胞明顯增加，而模型組陽(yáng)性細(xì)胞在肝小葉內(nèi)多為散在分布，也有成簇分布，凋亡細(xì)胞呈圓形或橢圓形，呈現(xiàn)棕褐色陽(yáng)性染色。與模型組相比，各給藥組大鼠的凋亡狀態(tài)有不同程度的減輕。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，與健康對(duì)照組相比，模型組的凋亡率明顯升高；與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組的凋亡率明顯降低（圖3A）。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組相比，模型組Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3的表達(dá)量明顯升高；與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3的表達(dá)量明顯降低，且具有一定的劑量依賴(lài)性（圖3B）。TUNEL與Western blot的檢測(cè)結(jié)果相符。

圖3 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC凋亡水平的影響Fig.3 Effect of eriodictyol on apoptosis level of DSSinduced UC rats

2.4 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的影響 與健康對(duì)照組相比，模型組MDA、GSH、LDH含量明顯升高，抗氧化酶SOD活性明顯降低；但與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組MDA、GSH、LDH含量明顯降低，SOD活性明顯升高，且具有一定的劑量依賴(lài)性（圖4）。

2.5 圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC AKT/NF-κB磷酸化的影響 與健康對(duì)照組相比，模型組p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)；與模型組相比，除DSS+圣草酚10 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSS+圣草酚20、40 mg/kg組p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，且具有一定的劑量依賴(lài)性（圖5）。

3 討論

UC臨床表現(xiàn)為持續(xù)腹痛、腹瀉、黏液膿血便，病情反復(fù)，患者備受折磨。目前的治療藥物在臨床使用上有一定的局限性。中藥具有多層次、多角度、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)，因此，從傳統(tǒng)中藥或天然成分出發(fā)，尋找安全有效的方法具有重要意義。此前有研究證明，圣草酚具有良好的抗炎活性，對(duì)關(guān)節(jié)炎、免疫性腦脊髓炎等疾病具有良好的改善作用，但未見(jiàn)圣草酚對(duì)UC的影響［10-11］。因此，本研究探討圣草酚對(duì)DSS誘導(dǎo)的大鼠UC的作用及機(jī)制。

目前，評(píng)估DAI、CMDI等反映UC的嚴(yán)重程度。此外，細(xì)胞因子的產(chǎn)生及表達(dá)與UC密切相關(guān)，是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，包括IL、IFN、TNF-α家族等。其中，抑制TNF-α通常作為臨床上治療炎癥性腸病的標(biāo)準(zhǔn)，IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子異常產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞大量死亡［12］。ZHANG等［13］的報(bào)道指出，HLJ2作為UC的潛在治療藥物，有效降低大鼠體質(zhì)量減輕、結(jié)腸攣縮、DAI、CMDI、HI，降低炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6的產(chǎn)生；ZHU等［14］的研究顯示，小檗堿通過(guò)抑制IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，上調(diào)IL-4和IL-10的表達(dá)，發(fā)揮抗炎效應(yīng)，緩解UC的炎癥程度。本研究顯示，用DSS誘導(dǎo)的大鼠UC模型出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、腹瀉、血便等現(xiàn)象，觀察顯示結(jié)腸粘連，大面積潰瘍，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與人體UC組織病理學(xué)變化相一致，而給予圣草酚的各組病理狀況得到改善，DAI、CMDI、HS評(píng)分也明顯降低。此外，圣草酚抑制促炎因子合成，促進(jìn)抗炎因子釋放，與上述研究一致。提示圣草酚能夠緩解DSS誘導(dǎo)的大鼠UC組織損傷程度，改善炎癥水平及免疫紊亂。

研究表明，在UC發(fā)病過(guò)程中，腸道細(xì)胞凋亡速率增加，分化中的結(jié)腸細(xì)胞大量死亡，未成熟隱窩細(xì)胞的過(guò)度增殖，嚴(yán)重破壞腸道屏障，致使炎癥、潰瘍、腸道功能紊亂的發(fā)生。其中Bax基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2基因抑制細(xì)胞凋亡，兩者通常以二聚體的形式發(fā)揮作用，Bax/Bcl-2決定細(xì)胞凋亡的發(fā)展進(jìn)程［15］。此外，Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，其激活與過(guò)表達(dá)可能直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中Caspase3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。本研究采用TUNEL與Western blot兩種方法檢測(cè)凋亡情況，結(jié)果顯示圣草酚通過(guò)減少細(xì)胞凋亡率，降低Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表達(dá)，改善DSS誘導(dǎo)的大鼠UC程度。

氧化應(yīng)激是UC的發(fā)病機(jī)制之一［17］。其中，丙二醛（MDA）是自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物［18］，可通過(guò)檢測(cè)MDA來(lái)判斷結(jié)腸黏膜氧自由基的水平及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)度、組織損傷程度；乳酸脫氫酶（LDH）是生物體內(nèi)糖酵解途徑中至關(guān)重要的氧化還原酶，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，LDH上升，細(xì)胞膜通透性增高，故LDH水平可作為腸上皮細(xì)胞的損傷監(jiān)測(cè)指標(biāo)；超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化金屬酶，當(dāng)SOD含量降低時(shí)，氧自由基清楚能力降低可組織細(xì)胞損傷。此外，NF-κB是調(diào)節(jié)免疫的關(guān)鍵。WANG等［19］的報(bào)道指出，圣草酚通過(guò)抑制小鼠炎癥性COX-2/NLRP3/NF-κB途徑改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷；AMIRSHAHROKHI等［20］研究顯示，非布索坦可通過(guò)抑制小鼠中的NF-κB、促炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激來(lái)緩解UC。本研究顯示圣草酚能夠減少M(fèi)DA、GSH、LDH水平，提高SOD活性，下調(diào)p-AKT/AKT、p-P65/P65的蛋白表達(dá)。提示，圣草酚能夠提高大鼠抗氧化能力，改善組織過(guò)氧化程度，降低DSS誘導(dǎo)的大鼠UC氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)下調(diào)AKT/NF-κB通路相關(guān)蛋白磷酸化表達(dá)，緩解DSS誘導(dǎo)的大鼠UC程度。

綜上所述，圣草酚能夠有效緩解DSS誘導(dǎo)的大鼠UC損傷程度，其機(jī)制可能與下調(diào)AKT/NF-κB通路相關(guān)蛋白的磷酸化表達(dá)，改善炎癥水平，減少細(xì)胞凋亡，提高大鼠抗氧化能力，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)。