補陽還五湯治療阿爾茨海默病的網絡藥理學研究及實驗驗證

李金堯，王雅夢，雷霞，趙晨宇，董曉紅，劉國良，張寧，*，劉斌*（.黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 54007）

補陽還五湯（BYHWD）為傳統(tǒng)中藥方劑，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花組成，具有補氣養(yǎng)血、通經活絡的作用，臨床上常用于治療血管性癡呆、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病[1-2]。有研究表明，BYHWD 對阿爾茨海默?。ˋD）也具有良好的治療效果，但其作用機制尚不明確[3-4]。網絡藥理學以生物數(shù)據(jù)庫及組學實驗數(shù)據(jù)為基礎，融合多學科原理和技術，可以預測參與機體生物學過程的作用靶點和通路途徑，為揭示中醫(yī)藥療效的多靶點機制研究提供新的方法和思路[5]。Qu 等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以降低血腦屏障（BBB）的通透性，減少外周有毒物質進入大腦，保護神經元。因此推測BYHWD 的神經保護作用可能與BBB 有關，通過網絡藥理學預測BYHWD 治療AD 的作用機制，并用動物實驗對網絡藥理學結果進行驗證，探討B(tài)YHWD如何達到治療AD 的效果。

1 材料

1.1 儀器與試藥

新物體識別設備（貨號：RD1121-NR-M）、避暗設備（貨號：RD1106-SB-M）（上海移數(shù)）；光學顯微鏡（貨號：IX-71-21PH，奧林巴斯）；轉輪式切片機（貨號：RM2016，德國LEICA）。蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號：C0105S，碧云天生物技術）；兔抗-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）多克隆抗體（貨號：125422）、兔抗-低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）多克隆抗體（貨號：124368）、兔抗-血管內皮細胞黏附分子1（VCAM-1）多克隆抗體（貨號：11989）、兔抗-載脂蛋白E（ApoE）多克隆抗體（貨號：119748）（愛必信）；辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗（貨號：PV-6001，中杉金橋）；山羊血清（貨號：SL038，北京Solarbio）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（貨號：W026，南京建成）；鹽酸多奈哌齊（貨號：S60449，源葉生物）；生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花均購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗中心田明教授鑒定生黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，當歸尾為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，赤芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHor 的干燥根莖，地龍為巨蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體，桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 的干燥成熟種子，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。取生黃芪1200 g、當歸尾60 g、赤芍45 g、川芎30 g、地龍30 g、桃仁30 g、紅花30 g 制備成BYHWD 水煎劑，經冷凍干燥制為干粉，出粉率是34.11%，得到干粉486 g，于4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

APP/PS1 雙轉基因小鼠和SPF 級C57BL/6J小鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2015-0001 號]，雄性，7月齡，體質量為（40±10）g。于無菌環(huán)境飼養(yǎng)，溫度保持在（21±1）℃，相對濕度（60±10）%，動物自由飲水進食。

1.3 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），HERB 數(shù)據(jù)庫（http：//herb.ac.cn/），UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），SwissADME數(shù)據(jù)庫（http：//www.swissadme.ch/），SwissTarget-Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/），DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/），HPO 數(shù)據(jù) 庫（https：//hpo.jax.org/），STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），Metascape 數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html），Cytoscape 3.7.2 軟件。

2 方法與結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1 BYHWD 成分收集及靶點預測 運用TCMSP、HERB 數(shù)據(jù)庫篩選黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花的化學成分信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為標準篩選有效成分和作用靶點。由于TCMSP 數(shù)據(jù)庫未收錄地龍，HERB 數(shù)據(jù)庫相關化學成分信息較少，其化學成分信息通過文獻檢索獲得，在SwissADME 平臺以可透過BBB、胃腸道吸收活性高、“Druglikeness”項有兩個及以上“Yes”為標準篩選有效成分，通過SwissTargetPrediction 平臺預測其作用靶點，用UniProt 數(shù)據(jù)庫校正為官方基因名。共收集到 BYHWD 活性成分118 個，其中黃芪20 個、當歸2 個、赤芍29 個、川芎7 個、桃仁23 個、紅花22 個、地龍15 個，刪除重復值后得到744 個作用靶點。

2.1.2 AD 靶點預測 分別登錄TTD、OMIM、DisGeNET、HPO 數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞搜索AD 的作用靶點，將四個數(shù)據(jù)庫得到的靶點整合取交集，并用UniProt 數(shù)據(jù)庫校正為官方基因名，最終整理出1607 個AD 作用靶點。

2.1.3 BYHWD 抗AD 潛在靶點的篩選 將BYHWD 的作用靶點和AD 作用靶點分別錄進Venny 作圖工具，取交集，得到163 個BYHWD抗AD 的潛在作用靶點，潛在作用靶點對應BYHWD 的89 個活性成分。

2.1.4 PPI 網絡的構建 將潛在作用靶點上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，將蛋白種屬設置為“Homo sapiens”，其余設置默認，進行 PPI 網絡的構建和分析，利用Cytoscape 3.7.2 可視化處理，見圖1。如圖1所示，該交互網絡中有163 個節(jié)點和2103個連線（顏色越深、節(jié)點越大表示連接度越高）。

圖1 BYHWD 抗AD 作用靶點的PPI 網絡Fig 1 PPI network of anti-AD targets of BYHWD

2.1.5 “組方藥材-活性成分-疾病靶點”網絡圖的構建 運用Cytoscape 3.7.2 軟件將7 個組方藥材、89 個活性成分、163 個交集靶點構建組方藥材-活性成分-疾病靶點網絡圖，見圖2（顏色越深、節(jié)點越大表示節(jié)點越重要）。

圖2 組方藥材-活性成分-疾病靶點網絡Fig 2 Medicinal material-active ingredient-disease target network

2.1.6 GO 及KEGG 富集分析 將潛在作用靶點輸入Metascape 基因富集在線工具，限定物種為“Homo sapiens”，進行GO 及KEGG 富集分析，以P＜0.05 篩選排名前10 的信息作GO 柱狀圖和KEGG 氣泡圖，借助微生信平臺將其可視化。GO 富集結果表示，生物過程主要涵蓋激酶活性調節(jié)、蛋白質磷酸化正調節(jié)、細胞對氮化合物的反應、MAPK 級聯(lián)調節(jié)等；細胞成分主要包括樹突、樹突樹、突觸后膜等；分子功能主要涉及蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶活性等（見圖3）。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)癌癥、AD、膽固醇代謝、脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號通路等與AD 密切相關（見圖4）。

圖3 GO 富集分析結果Fig 3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG 富集分析結果Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.2 動物實驗

2.2.1 動物分組及給藥 實驗小鼠隨機分為6 組，20 只C57BL/6J 小鼠作為對照組，APP/PS1 雙轉基因小鼠按照每組20 只，隨機分為模型組，陽性藥多奈哌齊組，BYHWD 高劑量、中劑量和低劑量組。模型組和對照組每日灌胃同樣體積的生理鹽水，多奈哌齊組小鼠灌胃0.001 g/（kg·d）劑量的多奈哌齊，BYHWD 高劑量、中劑量和低劑量組分別灌胃37.06、18.53、9.26 g/（kg·d）劑量的BYHWD（生藥量），灌胃持續(xù)35 d。

2.2.2 新物體識別實驗 將兩個完全相同的物體放置在曠場箱內，距離為25 cm，放入小鼠讓其自由探索10 min，取出，將其中一個物體替換為不同顏色、形狀和材質的新物體。讓小鼠休息5 h后，再放在與上次一樣的位置，自由移動10 min。記下對新鮮物體的探索時間（Tn）和熟悉物體的探索時間（Tf），用識別指數(shù)（Ti）[Ti＝Tn/（Tn＋Tf）×100%]表示小鼠對物體識別的能力，結果見表1。與對照組相比，模型組小鼠的新物體識別指數(shù)下降（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD各劑量組新物體識別指數(shù)上升（P＜0.001）。

表1 BYHWD 對APP/PS1 小鼠新物體識別實驗的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表1 BYHWD 對APP/PS1 小鼠新物體識別實驗的影響(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

組別識別指數(shù)/%對照組37.59±2.15模型組14.94±2.29***多奈哌齊組29.73±1.89###BYHWD 高劑量組32.47±2.02###BYHWD 中劑量組31.39±1.78###BYHWD 低劑量組25.10±1.68###

2.2.3 避暗實驗 訓練前將小鼠背向洞口放置于明室，適應2 min 后，暗室通40 V 電流，記錄下每只小鼠潛伏期（即小鼠第一次進入暗室的時間）。每次訓練5 min，每日訓練3 次，連續(xù)訓練2 d 以改善小鼠的避暗行為。若小鼠在5 min 內沒有入洞，則棄去。24 h 后開始測試，記錄小鼠的避暗潛伏期和5 min 內的進入次數(shù)（即錯誤次數(shù)）。結果見表2。與對照組相比，模型組小鼠避暗潛伏期減短，錯誤次數(shù)增多（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD 各劑量組避暗潛伏期增長，錯誤次數(shù)減少（P＜0.001）。

表2 BYHWD 對APP/PS1 小鼠避暗實驗的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表2 BYHWD 對APP/PS1 小鼠避暗實驗的影響(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：與對照組相比，***P＜0.001；與模型組相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

組別避暗潛伏期/s錯誤次數(shù)對照組263.43±14.551.15±0.32模型組124.00±20.11***2.80±0.48***多奈哌齊組234.54±20.20###1.61±0.31###BYHWD 高劑量組228.17±17.10###1.68±0.30###BYHWD 中劑量組220.35±17.34###1.78±0.20###BYHWD 低劑量組212.72±17.26###1.79±0.27###

2.2.4 HE 染色 取出海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇及二甲苯脫水，每步15～20 min，石蠟包埋備用。切片后用蘇木素-伊紅進行染色、封片，在顯微鏡下觀察小鼠海馬的病理學改變，結果見圖5。對照組小鼠海馬CA1 區(qū)細胞體積較大，結構清晰，染色均勻。模型組CA1 區(qū)細胞數(shù)量少，體積小，胞質不豐富，可見空泡類物質。多奈哌齊組細胞與模型組相比數(shù)量較多，排列緊密，結構清晰。BYHWD 高劑量組CA1 區(qū)細胞數(shù)量多，體積大，結構清晰；BYHWD 中劑量組CA1 區(qū)細胞略多，體積略大，結構清晰；BYHWD 低劑量組CA1區(qū)細胞排列分散無序，結構不清晰。

圖5 BYHWD 對APP/PS1 小鼠海馬形態(tài)的影響（×400）Fig 5 Effect of BYHWD on the hippocampal morphology in the APP/PS1 mice（×400）

2.2.5 IHC 法 取海馬組織切片進行脫蠟、脫水，抗原修復后用3%H2O2孵育10 min，PBS 清洗3 次；滴加血清封閉20 min，棄去血清；加入50 μL PBS稀釋過的一抗（1∶300），室溫靜置1 h，PBS 清洗3 次；滴加50 μL 二抗（1∶500），室溫靜置30 min，PBS 清洗3 次；DAB 顯色5～10 min，流水沖洗終止顯色；蘇木精復染，脫水、透明、封片。顯微鏡觀察海馬區(qū)RAGE、LRP1、ApoE 和VCAM-1陽性細胞，利用取上不取下的方法對壓邊線的細胞計數(shù)。結果見表3及圖6，與對照組相比，模型組LRP1、ApoE 陽性細胞數(shù)表達降低，RAGE、VCAM-1 陽性細胞數(shù)表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與模型組相比，BYHWD 各劑量組LRP1、ApoE 陽性細胞數(shù)表達增加，RAGE、VCAM-1 陽性細胞數(shù)表達顯著降低（P＜0.001）。

圖6 BYHWD 對APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 蛋白表達的影響（×400）Fig 6 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of the APP/PS1 mice（×400）

表3 BYHWD 對APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表達的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表3 BYHWD 對APP/PS1 小鼠海馬RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表達的影響(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：與對照組相比，***P＜0.001；與模型組相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

組別RAGELRP1ApoEVCAM-1對照組22.75±1.4586.86±3.3742.55±3.20 48.29±10.59模型組48.79±3.11***12.39±1.05*** 8.72±1.94***363.30±5.28***多奈哌齊組26.03±2.35###67.80±4.04###33.58±1.91###123.50±1.20###BYHWD 高劑量組24.03±1.04###48.74±3.17###25.03±2.57### 64.51±2.48###BYHWD 中劑量組34.07±3.48###25.56±2.13###18.54±1.82###182.90±10.90###BYHWD 低劑量組32.83±2.36###35.36±0.57###15.05±1.39###234.60±25.50###

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 18.0 分析處理實驗數(shù)據(jù)，均值加減標準差（±s）進行表示，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差分析進行比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

氣虛血瘀，腦絡瘀阻，腦失濡養(yǎng)是AD 發(fā)生發(fā)展的重要病機，與之相適應，益氣活血通絡為其主要治則[7]。BYHWD 中君藥黃芪補氣行血，臣藥當歸活血祛瘀，佐以赤芍、川芎、桃仁、紅花助當歸活血化瘀，地龍通經活絡，全方共奏補氣、活血、化瘀通絡之效。已有研究證實BYHWD 對AD 有很好的作用[3-4]，但作用機制尚不明確。而祛瘀通絡藥可以通過改善BBB 對腦源性疾病進行治療[8]。BYHWD 作為祛瘀通絡藥，很有可能通過改善BBB 治療AD，本文運用網絡藥理學和動物實驗探究BYHWD 治療AD 的作用機制。

與前期BYHWD 網絡藥理學研究相比[9]，本文補充了AD 靶點，通過文獻檢索等方法豐富了組方藥材的活性成分及作用靶點，將BYHWD 抗AD 的潛在靶點由33 個豐富至163 個。KEGG 分析結果發(fā)現(xiàn)BYHWD 主要通過AD、膽固醇代謝、脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 等信號通路治療AD。潛在核心靶點VCAM-1、ApoE 與這些通路密切相關。AD 通路中VCAM-1、ApoE 的上游，RAGE/LRP1 轉運體已被證實可以介導 Aβ跨BBB 轉運，RAGE 介導 Aβ的內吞轉運，LRP1 介導 Aβ的外排轉運[10]，這與前期猜想一致，說明BYHWD 可通過改善BBB 達到治療AD 的作用。

目前，AD 的主要病理特征是腦內Aβ異常沉積形成的老年斑和tau 蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結，中樞Aβ含量是核心發(fā)病因素。VCAM-1 是RAGE 的配體[11]，為可誘導的血管細胞黏附分子，研究證實AD 患者RAGE 水平升高，Aβ內吞轉運增強，Aβ過渡沉積可刺激VCAM-1 表達，其表達水平還與炎癥細胞因子相關[12-13]。ApoE 是LRP1 的配體，可與 Aβ結合成復合物，通過BBB 跨膜轉運進入外周血液或被溶酶體吞噬降解[14-15]。高度脂化的ApoE 可以大幅增強與Aβ的親和性，從而促進胰島素降解酶對Aβ的降解能力，有效清除腦內Aβ。

本文利用動物實驗檢測BYHWD 給藥后RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 的表達水平，對網絡藥理學預測結果進行實驗驗證，進一步探究BYHWD 是否通過調節(jié)RAGE/LRP1 轉運體，改善BBB 轉運異常，發(fā)揮抗AD 的作用。

基于APP/PS1 小鼠的特點，該動物模型適用于藥物對AD 預防及治療的基礎性研究[16]。學習和記憶障礙是AD 早期出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)[17]，且貫穿于整個疾病過程中，本文根據(jù)學習記憶障礙的改善情況來評價BYHWD 對APP/PS1 小鼠的治療效果。與空間學習記憶相關的主要區(qū)域位于海馬區(qū)，海馬區(qū)對于情緒記憶方面也具有調節(jié)作用。研究表明，隨著海馬區(qū)損毀程度加大，空間學習記憶能力會不斷下降直至喪失，而且對于情緒記憶的能力也隨之下降[18-19]。故本文先通過行為學實驗發(fā)現(xiàn)給藥后APP/PS1 小鼠的新物體識別指數(shù)得到改善，避暗潛伏期上升，錯誤次數(shù)下降，表明BYHWD 可改善動物的學習記憶能力。又利用HE 染色觀察海馬神經元結構，從形態(tài)學角度再次驗證BYHWD 對APP/PS1 小鼠的治療效果。IHC 結果表明，經BYHWD 干預后，海馬LRP1、ApoE 表達水平上調，RAGE、VCAM-1 表達水平下調，證明BYHWD 可通過調節(jié)RAGE/LRP1 轉運體，改善APP/PS1 小鼠學習記憶能力。

綜上，本文根據(jù)BYHWD 傳統(tǒng)功效猜測其可能通過改善BBB 治療AD，網絡藥理學篩選出BYHWD 抗AD 潛在核心靶點VCAM-1、ApoE，研究證明它們的上游——RAGE/LRP1 轉運體已明確可以介導 Aβ跨BBB 轉運。經過動物實驗發(fā)現(xiàn)BYHWD 給藥后可以改善APP/PS1 小鼠學習記憶能力，治療機制與調節(jié)RAGE/LRP1 轉運體關鍵蛋白表達有密切關聯(lián)，即上調LRP1、ApoE，下調RAGE、VCAM-1，驗證了網絡藥理學的預測及前期猜想。本研究為BYHWD 治療AD 提供了理論基礎，但其具體機制還有待進一步研究。