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    基于HPLC-CAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析不同產(chǎn)地北柴胡藥材質(zhì)量

    2022-11-16 08:49:20周麗娟楊曉寧王雅芝張超王玉龍孫欣光北京振東光明藥物研究院有限公司北京00085山西振東道地藥材開(kāi)發(fā)有限公司山西長(zhǎng)治04700
    中南藥學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:柴胡皂苷檢測(cè)器產(chǎn)地

    周麗娟,楊曉寧*,王雅芝,張超,王玉龍,孫欣光*(.北京振東光明藥物研究院有限公司,北京 00085;.山西振東道地藥材開(kāi)發(fā)有限公司,山西 長(zhǎng)治 04700)

    柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumwilld.的干燥根,前者習(xí)稱(chēng)北柴胡,春秋二季采挖,除去莖葉和泥沙,干燥。柴胡具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣等功效,臨床用于感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等[1]。藥理學(xué)研究表明,柴胡具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2-4]。我國(guó)柴胡資源豐富,分布廣泛,人工栽種主要以北柴胡為主,且在山西和甘肅等地的栽種面積最大。

    柴胡藥材含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、多糖等多種活性成分[2,5-6],目前多以柴胡皂苷來(lái)評(píng)價(jià)柴胡的質(zhì)量,2020年版《中國(guó)藥典》一部“柴胡”藥材項(xiàng)下,僅以柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 作為質(zhì)控指標(biāo)[1]。中藥成分復(fù)雜多樣,其臨床藥效的發(fā)揮是所含化學(xué)成分共同作用的結(jié)果,因此,單一或幾個(gè)成分的含量測(cè)定很難全面地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量,而中藥指紋圖譜可以從整體上對(duì)中藥的成分進(jìn)行分析,能較全面地反映中藥質(zhì)量,體現(xiàn)中藥材質(zhì)量的整體性[7-8],因此本研究建立了柴胡藥材的指紋圖譜,并對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡藥材進(jìn)行了研究。

    目前關(guān)于柴胡藥材指紋圖譜的研究大多采用紫外檢測(cè)器(UV)或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)[9-12]。UV 靈敏度高、噪聲低、線(xiàn)性范圍寬,但是不適用于無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收化合物的分析;ELSD 為通用檢測(cè)器,但其靈敏度低、重現(xiàn)性較差。電噴霧檢測(cè)器(CAD)作為一種通用型檢測(cè)器,其檢測(cè)不依賴(lài)于分析物的分子結(jié)構(gòu),尤其適用于皂苷類(lèi)、糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、脂類(lèi)化合物等無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析[13-14]。同時(shí)CAD 是一個(gè)質(zhì)量敏感型檢測(cè)器,其檢測(cè)的響應(yīng)值與進(jìn)樣成分的含量相關(guān),且具有較高的靈敏度和較低的檢測(cè)限[15-16],特別適合中藥指紋圖譜的全面成分分析,可定量化表征其中的化學(xué)成分,在中藥成分檢測(cè)及質(zhì)量研究方面得到廣泛應(yīng)用[17-21]。柴胡皂苷類(lèi)成分具有較弱的紫外吸收,不適合采用UV 檢測(cè),與ELSD 相比CAD 具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限,因此選擇HPLC-CAD 法建立柴胡藥材的指紋圖譜。

    本研究建立了北柴胡HPLC-CAD 藥材指紋圖譜方法,標(biāo)定共有峰,并結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析(CA)、主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)對(duì)不同產(chǎn)地北柴胡成分進(jìn)行成分表征及質(zhì)量差異研究,為北柴胡藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料

    Uitimate 3000 型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司);ME204/02 型萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);MSA36S-0CE-DH 型百萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);Milli-Q 超純水儀(美國(guó)Millipore 公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)。

    色譜乙腈、甲醇(FEPRUE);分析純甲酸(MREDA);純水(MiLLi-Q 制備)。柴胡皂苷a(批號(hào):110777-201912,純度:94.8%)、柴胡皂苷d(批號(hào):110778-201912,純度:96.3%)(中國(guó)食品藥品檢定研究院);柴胡皂苷c(批號(hào):PS000193,純度:99.65%)、柴胡皂苷e(批號(hào):PS200702-15,純度:99.94%)(成都普思生物科技股份有限公司);柴胡皂苷f(shuō)(批號(hào):6131,純度:99.7%,上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)。北柴胡藥材均購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng),經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm× 4.6 mm,3.5 μm);流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~20 min,10%~30%B;20~35 min,30%~35%B;35~60 min,35%~40%B;60~65 min,40%~45%B;65~70 min,45%B;70~85 min,45%~65%B;85~90 min,65%~85%B;90~100 min,85%~90%B;100~105 min,90%~95%B);柱溫40℃;流速1.4 mL·min-1;進(jìn)樣量20 μL,CAD 霧化室溫度50℃。

    2.2 對(duì)照品溶液的制備

    取柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷e、柴胡皂苷f(shuō) 對(duì)照品,分別精密稱(chēng)定,加80%甲醇制成每1 mL 分別含0.10 mg、50 μg、0.15 mg、20 μg、50 μg 的混合對(duì)照品溶液。

    2.3 供試品溶液的制備

    取柴胡藥材粉末(過(guò)3 號(hào)篩),約1.0 g,精密稱(chēng)定,加80%甲醇25 mL,稱(chēng)重,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,取出,放冷,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),即得。

    2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

    2.4.1 精密度試驗(yàn) 取柴胡藥材(S1),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次。以柴胡皂苷d(13 號(hào)峰)的保留時(shí)間和峰面積為參照,計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%,相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%,表明儀器精密度良好。

    2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取柴胡藥材(S1),按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液。進(jìn)樣檢測(cè)。以柴胡皂苷d(13 號(hào)峰)的保留時(shí)間和峰面積為參照,計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%,相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取柴胡藥材(S1),按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0、4、8、12、20、30、48 h 進(jìn)樣檢測(cè)。以柴胡皂苷d(13 號(hào)峰)的保留時(shí)間和峰面積為參照,計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%,相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%,表明室溫放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.5 柴胡指紋樣品圖譜的建立

    取16 批不同產(chǎn)地的北柴胡藥材,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣檢測(cè)。將指紋圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》(2012.0 版本)中,以S1 為參考圖譜,手動(dòng)匹配16 批指紋圖譜,見(jiàn)圖1,根據(jù)匹配結(jié)果確定22 個(gè)共有峰,并生成對(duì)照指紋圖譜,見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)了其中的5 個(gè)峰,其中13 號(hào)峰(柴胡皂苷d)峰形好,峰面積穩(wěn)定,分離度較好,選定為指紋圖譜的參照峰(S),見(jiàn)圖3。

    圖1 16 批北柴胡藥材的指紋圖譜Fig 1 Fingerprints for 16 batches of Bupleurum chinense

    圖2 北柴胡藥材對(duì)照指紋圖譜Fig 2 Reference fingerprint of Bupleurum chinense

    圖3 空白溶劑(A)、對(duì)照品(B)和樣品(C)的色譜圖Fig 3 Reference chromatogram of blank solvent(A),control(B)and sample(C)

    2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

    2.6.1 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》計(jì)算16 批北柴胡藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度,結(jié)果見(jiàn)表1。16 批北柴胡藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.90,除樣品S8 和S9 外(產(chǎn)地均為陜西),其他14 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.919~0.991,可見(jiàn)不同產(chǎn)地的柴胡藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

    表1 16 批北柴胡樣品相似度結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 16 batches of Bupleurum chinense

    2.6.2 CA 將16 批樣品的22 個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 軟件進(jìn)行CA,采用組間連接法結(jié)合歐氏距離的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖4,16 批柴胡藥材大致可以被分成兩大類(lèi)(山西一類(lèi),陜西、河北和甘肅為一類(lèi)),其中陜西、河北和甘肅3 個(gè)產(chǎn)地的藥材中陜西的藥材可以單獨(dú)分成一小類(lèi),甘肅和河北的藥材沒(méi)有明顯區(qū)分。不同產(chǎn)地的北柴胡藥材雖然相似度較高,但不同產(chǎn)地的北柴胡藥材化學(xué)成分仍存在一定差異,從熱圖可知,22 個(gè)指紋特征峰在不同柴胡藥材中存在一定差異(見(jiàn)圖5)。

    圖4 16 批北柴胡藥材的聚類(lèi)分析Fig 4 Cluster analysis based on 16 batches Bupleurum chinense

    圖5 16 批北柴胡藥材的22 個(gè)指紋特征峰熱圖Fig 5 Heat-map of 22 comment peaks in 16 batches Bupleurum chinense

    2.6.3 PCA、PLS-DA 為尋找不同產(chǎn)地柴胡的質(zhì)量差異成分,將16 批北柴胡樣品的22 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行PCA,得到PCA 得分圖,再進(jìn)行監(jiān)督模式識(shí)別方法PLSDA 建模分析,獲得相應(yīng)的模型[22-24],如圖6所示。4 個(gè)產(chǎn)地的16 批北柴胡藥材聚類(lèi)趨勢(shì)明顯,可以分為三類(lèi),S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7分為一類(lèi)(產(chǎn)地均為山西)、S8、S9、S10 分為一類(lèi)(產(chǎn)地均為陜西)、其余樣品分為一類(lèi)(產(chǎn)地為甘肅和河北),與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

    圖6 16 批北柴胡藥材的PCA(A)和OPLS-DA(B)得分圖Fig 6 PCA(A)and OPLS-DA(B)scores plots from principle components analysis of Bupleurum chinense

    為進(jìn)一步說(shuō)明各個(gè)共有峰變量差異大小,采用變量重要性投影(VIP)法篩選導(dǎo)致樣品分類(lèi)差異較大的成分,各成分的VIP 值見(jiàn)圖7。VIP是篩選差異性化合物的重要指標(biāo),VIP 值越高,對(duì)組間差異的影響越大。以VIP >1 為標(biāo)準(zhǔn),篩選出對(duì)樣品分類(lèi)起關(guān)鍵性作用的9 個(gè)成分,按照VIP 大小依次為色譜峰6(柴胡皂苷c)、色譜峰16、色譜峰3、色譜峰18、色譜峰14、色譜峰7(柴胡皂苷f(shuō))、色譜峰8(柴胡皂苷a)、色譜峰1、色譜峰5,這些成分初步擬訂為不同產(chǎn)地柴胡藥材質(zhì)量差異的主要化學(xué)標(biāo)志物。

    圖7 北柴胡PLS-DA 的VIP 值Fig 7 PLS-DA VIP value diagram of Bupleurum chinense

    3 討論

    建立藥材系統(tǒng)、全面的指紋圖譜是進(jìn)行藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效辦法之一[25-26]。本研究建立了基于HPLC-CAD 的柴胡指紋圖譜方法,對(duì)收集于具有代表性地域的北柴胡藥材進(jìn)行全面成分表征及質(zhì)量評(píng)價(jià),能夠表征出柴胡藥材更加全面的色譜峰信息,特別是具有弱紫外吸收的皂苷類(lèi)成分在CAD 檢測(cè)器下得到了良好的檢測(cè)和分離。近年來(lái),CAD 檢測(cè)器因其自身特點(diǎn),在中藥皂苷類(lèi)檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用[27-29]。

    本研究采用指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、CA、PCA 和PLS-DA 等多元統(tǒng)計(jì)分析方法,對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡藥材進(jìn)行分析評(píng)價(jià),結(jié)果具有良好的一致性,說(shuō)明此方法能夠?qū)λ幉馁|(zhì)量進(jìn)行全面反映,可以用作中藥整體質(zhì)量控制的有效方法[24]。

    北柴胡藥材之間的相似度較高,但不同產(chǎn)地的北柴胡藥材在成分含量上仍存在差異[30-31]。本研究建立的HPLC-CAD 指紋圖譜結(jié)合PCA 分析表明不同產(chǎn)地北柴胡藥材化學(xué)成分存在差異,同時(shí)利用PLS-DA 分析篩選出造成不同產(chǎn)地北柴胡差異性的9 個(gè)成分,其中包括2020年版《中國(guó)藥典》一部項(xiàng)下柴胡藥材的含量檢測(cè)指標(biāo)柴胡皂苷a。后續(xù)還需對(duì)不同產(chǎn)地北柴胡藥材成分含量差異進(jìn)行更深入的研究,以期為北柴胡的質(zhì)量控制以及資源利用提供依據(jù)。

    綜上所述,本文建立了一種簡(jiǎn)便、高效的HPLC-CAD 指紋圖譜方法,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可用于北柴胡藥材差異分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)。所建立的HPLC-CAD 指紋圖譜可全面科學(xué)地為北柴胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立提供參考。

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