骨髓間充質干細胞及其外泌體治療終末期肝病的研究進展

梁 悅，胡永紅，劉 偉，慕永平，陳佳美，劉 平,3

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，上海 201203；2 肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203；3 上海中醫(yī)藥大學交叉科學研究院，上海市中醫(yī)藥化學生物學前沿基地，上海 201203

終末期肝病(end-stage liver disease, ESLD)以肝功能不能滿足人體的正常生理需求為特征，是各種急、慢性肝損傷所致的晚期階段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代償期肝硬化及肝衰竭。本類疾病病死率高、醫(yī)療負擔重，嚴重危害人民健康。肝移植作為臨床有效治療方法，存在供體短缺、費用高昂等問題[1]。近年來細胞療法研究突顯間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)治療肝病的潛在臨床應用優(yōu)勢。MSC可從骨髓、脂肪、臍帶血以及胚胎等組織分離，但不同來源的MSC的生物學特性不同。一項研究[2]表明，骨髓來源MSC遷移能力最強，而這種能力是組織再生修復過程中不可或缺的因素。同時，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)具有強大的旁分泌功能，特別是其來源的外泌體在肝病治療中頗受關注。本文就BMSC及其外泌體在ESLD中的研究進展作一綜述，為進一步臨床應用研究提供部分參考。

1 BMSC及其外泌體概述

BMSC是源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，可在體外培養(yǎng)擴增，并能在特定條件下分化為多種組織細胞，如骨、軟骨、心肌細胞、上皮細胞等。目前BMSC仍缺乏特異性標志物，通常認為其表達CD73、CD90和CD105，而不表達CD14、CD34和CD45。由于免疫原性低，不易觸發(fā)受體免疫反應，BMSC適用于同種異體或自體移植。BMSC可以遷移到受損肝組織并直接分化為肝細胞，也可旁分泌可溶性因子，如前列腺素E2、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、吲哚胺2，3-雙加氧酶和血管內皮生長因子等以改善肝組織微環(huán)境，促進受損肝細胞修復[3-4]。

外泌體是由細胞內的多泡小體與細胞膜融合并釋放到細胞外空間的細胞外囊泡，直徑40～160 nm，是一種新的非細胞性的信號傳遞方式。外泌體攜帶大量生物活性物質，包括蛋白質、脂質、DNA、mRNA、微小RNA，通過不同的信號通路誘導靶細胞活性的改變。外泌體幾乎可由各種細胞類型分泌和吸收，BMSC是其重要細胞來源[5]。與BMSC相比，BMSC來源外泌體(bone marrow mesenchymal stem cells-Exosome，BMSC-Ex)更容易獲取，不存在免疫排斥反應，安全性更好，且具有跨生物屏障能力，可開發(fā)為藥物遞送載體。BMSC-Ex向受損肝臟傳遞生物信息，參與調控肝細胞再生、肝纖維化與肝臟炎癥損傷等病理生理過程[6-7]。

2 BMSC移植治療ESLD的臨床應用

已有大量臨床研究表明，BMSC移植治療以失代償期肝硬化與肝衰竭為代表的ESLD具有顯著的臨床效果。

2.1 治療失代償期肝硬化的臨床研究 失代償期肝硬化是慢性肝病的終末階段，由于廣泛的肝細胞壞死與肝組織結構破壞，造成肝功能失代償，出現一系列嚴重并發(fā)癥[8]。BMSC移植對多種原因引起的失代償期肝硬化具有良好療效。一項臨床試驗[9]招募了56例乙型肝炎肝硬化患者，經肝動脈注入自體BMSC，隨訪24周，共39例患者完成試驗，其中移植組20例，對照組19例。結果顯示，自體BMSC移植組患者的肝功能、終末期肝病模型(MELD)評分和Child-Pugh評分改善程度顯著優(yōu)于常規(guī)治療組。同樣，自體BMSC經外周靜脈移植治療丙型肝炎肝硬化[10]，經肝動脈移植治療酒精性肝硬化[11]均能改善患者肝功能并減輕纖維化程度。然而，并非所有研究均呈現BMSC移植對肝硬化患者有理想療效。如一項隨機對照臨床研究[12]招募了27例肝硬化失代償期患者，其中15例患者從外周靜脈注射自體BMSC，12例患者注射等體積的生理鹽水作為對照，12個月后觀察兩組的肝功能、Child-Pugh評分、MELD評分、國際標準化比值(INR)變化均無顯著差異。這可能與BMSC移植的細胞數量、移植途徑以及移植前是否預處理等因素有關。

2.2 治療肝衰竭的臨床研究 肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝損傷，導致肝功能嚴重障礙，出現以黃疸、腹水、凝血功能障礙、肝性腦病等為主要表現的一組臨床癥候群。一項隨機對照臨床試驗[13]經外周靜脈輸注自體BMSC治療乙型肝炎相關肝衰竭患者，每周1次，持續(xù)4周，隨訪24周，結果顯示，BMSC移植組累積存活率(73.2%)顯著高于常規(guī)治療組(55.6%)，且BMSC移植可顯著降低患者血清TBil水平、改善MELD評分以及降低嚴重感染的發(fā)生率，提高24周生存率。另有研究[14]對BMSC進行預處理后注入丙型肝炎相關肝衰竭患者體內觀察其療效。20例患者經皮下注射粒細胞集落刺激因子5 d后抽取其BMSC，經分離純化后由外周靜脈輸注于自體接受治療；隨訪26周以上，移植組中54%患者的血清ALT、AST恢復正常，肝臟合成功能改善。另一項研究[15]將自體BMSC向肝細胞樣細胞誘導分化后移植入體內，隨訪6個月，結果顯示，BMSC移植可顯著改善肝衰竭患者的腹水、下肢水腫、血清白蛋白含量和Child-Pugh評分。

3 BMSC移植治療ESLD的作用機制

ESLD的病理學特點是大量肝組織炎癥壞死及膠原纖維沉積。對重度肝損傷、肝纖維化模型的干預研究均表明，BMSC移植療法可促進肝細胞再生，減輕肝臟炎癥及抑制肝纖維化進程(圖1)。

圖1 BMSC及其外泌體治療ESLD的作用機制

3.1 BMSC促進肝細胞再生 肝細胞作為肝實質細胞的主要組成部分，負責肝臟生物合成、轉化、代謝等功能，維持肝臟穩(wěn)態(tài)。持續(xù)的慢性肝損傷造成大量肝細胞壞死、凋亡，肝細胞增殖能力嚴重不足，無法滿足機體肝功能需求。因此，有效促進肝細胞再生是治療ESLD的重要途徑。BMSC移植療法促進肝再生。如給D-半乳糖胺/脂多糖[16]以及90%肝切除[17]誘導的肝衰竭大鼠注射BMSC，肝組織增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、Ki-67陽性染色面積顯著增加，且肝細胞中β-catenin發(fā)生核易位，上調原癌基因和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表達，促進肝細胞增殖。這種現象與BMSC歸巢至受損肝臟，通過直接分化或旁分泌功能促進肝細胞再生有關。給CCl4誘導的肝纖維化小鼠[18]尾靜脈注射BMSC，綠色熒光蛋白標記的BMSC遷移到受損肝臟，肝組織肝細胞標志物Alb的表達升高。在細胞因子包括HGF、血管內皮生長因子、半乳糖凝集素-3或巨噬細胞集落刺激因子的作用下[3,19-20]，BMSC向肝臟歸巢并分化為肝細胞樣細胞的能力增強。BMSC向肝臟歸巢的機制并未完全闡明，研究[21]表明與SDF-1/CXCR4軸活化有關。肝損傷時肝組織SDF-1表達升高，刺激其受體CXCR4在BMSC表面的表達上調，進而介導BMSC遷移至受損肝組織。

外泌體是BMSC旁分泌機制的重要組成部分，發(fā)揮與其母體細胞類似的生物學功能。動物實驗[22]表明，BMSC-Ex可遷移至刀豆球蛋白-A(concanavalin A，Con-A)誘導的肝損傷小鼠肝臟，抑制肝細胞凋亡，同時促進肝組織再生修復。細胞實驗[23]證實，BMSC-Ex通過自噬途徑抑制肝細胞凋亡，顯著降低促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，而上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。同時，可誘導肝細胞損傷模型中G0期肝細胞重新進入G1期，顯著上調cyclin D1和PCNA的表達，加速肝細胞再生周期[24]。

3.2 BMSC抑制肝纖維化進展 肝纖維化是響應慢性肝損傷的病理變化，是失代償期肝硬化的重要病理基礎。肝損傷刺激肝星狀細胞(HSC)活化，并轉分化為表達α-SMA的肌成纖維細胞，分泌大量膠原，導致細胞外基質過度沉積[8]。動物實驗[25]表明，BMSC移植可減輕CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，發(fā)揮顯著的抗肝纖維化作用。這種作用主要歸結于BMSC可抑制HSC活化并誘導活化的HSC凋亡。在采用TGFβ1誘導人HSC活化細胞模型[26]中觀察到，BMSC干預后，HSC的活化能力顯著減弱，且α-SMA和Ⅰ型膠原的表達顯著下降。BMSC可通過調控多條信號通路作用于HSC發(fā)揮抗肝纖維化作用。給硫代乙酰胺誘導的肝硬化大鼠移植BMSC后，肝組織TGFβ1及其下游受體Smad3的表達水平顯著降低，且α-SMA的表達減少，提示BMSC可通過調控TGFβ/Smad信號通路抑制HSC活化進而改善肝纖維化[27]。NADPH氧化酶是自由基(ROS)的主要來源，ROS參與肝纖維化病理過程。BMSC降低HSC中ROS的標志物4-HNE與NOX的亞型p47phox的表達，通過調控NADPH氧化酶通路抑制HSC活化[26]。另外，細胞外基質的合成與降解受基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)調控。BMSC移植可上調肝組織MMP-9的表達，下調肝組織TIMP-1的表達，促進細胞外基質降解[28]。

BMSC-Ex也能有效干預HSC活化環(huán)節(jié)，阻止肝纖維化進展。在CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型[29]中，人來源BMSC-Ex能抑制HSC中Wnt/β-catenin通路信號轉導，減少HSC增殖、活化，從而減輕肝纖維化。此外，外泌體可作為信號遞送載體在細胞間傳遞。通過質粒轉染環(huán)狀DNA circDIDO1進入BMSC中，隨后circDIDO1成功包裝到BMSC-Ex內，分離攜帶circDIDO1的BMSC-Ex并與LX2細胞共孵育，發(fā)現BMSC-Ex介導的circDIDO1轉移通過上調PTEN以抑制AKT信號通路活性，從而抑制HSC的活化[30]。

3.3 BMSC參與免疫調控 BMSC具有強大的調控免疫的能力，通過改善肝臟免疫細胞狀態(tài)，抑制促炎因子分泌，減輕肝臟炎性損傷。巨噬細胞是固有免疫的主要參與者，通常認為M1型巨噬細胞具有促炎作用，而M2型巨噬細胞具有抗炎作用。在CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型[31]中，BMSC干預后促進巨噬細胞向M2亞型極化，抑制其向M1亞型極化，從而降低炎性因子IL-12b、IFNγ、TNFα和IL-6的表達，減輕炎癥反應。同樣，BMSC干預Con-A誘導的肝損傷小鼠后，M2型巨噬細胞數量增多，且血清IL-10水平上調并刺激信號傳導及轉錄激活蛋白3的磷酸化，進而降低肝組織TUNEL陽性細胞數量和cleaved-Caspase3/8/9的蛋白表達，抑制肝細胞凋亡[32]。BMSC也可調控Hedgehog/SMO/Gli1通路和Notch1信號發(fā)揮抑制炎癥作用，BMSC上的CD47和巨噬細胞中SIRPα直接結合可誘導巨噬細胞Gli1和Notch1胞內結構域(notch1 intracellular domain，NICD)的核易位，而NICD與Gli1相互作用并調節(jié)其靶基因Dvl2，進而抑制NLRP3炎癥小體驅動的炎癥反應[33]。T淋巴細胞被激活后，大量增殖、分化，同時釋放促炎因子以發(fā)揮其效應功能[34]。BMSC抑制肝臟T淋巴細胞向CD4+亞型分化，進而降低血清促炎因子與肝組織α-SMA的表達，減輕炎癥與纖維化[35]。同樣，使用攜帶Becn1-shRNA慢病毒載體轉染的BMSC也顯示出抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖能力[36]。此外，將肝臟脫細胞生物支架植入大鼠體內，外周靜脈輸注BMSC后能減輕中性粒細胞浸潤和纖維組織形成，但這作用僅能維持2周左右[37]。

在膽汁淤積性肝損傷環(huán)境下，肝臟血管內皮黏附分子1表達升高，招募中性粒細胞與CD8+T淋巴細胞，促進膽道周圍炎性損傷以及纖維化；而BMSC-Ex可降低血管內皮黏附分子1的表達，減少免疫細胞浸潤，保護肝臟免受炎癥損傷[38]。另外，外泌體包含的miRNA是其發(fā)揮作用的重要生物活性物質之一。研究[39]發(fā)現使用慢病毒轉染過表達miR-223的BMSC-Ex能夠改善小鼠肝功能與肝組織炎性損傷，且顯著降低肝組織NLRP3和Caspase-1的表達，而抑制BMSC-Ex中miR-223的表達后其治療作用消失，提示BMSC-Ex中miR-223通過抑制NLRP3炎癥小體信號通路發(fā)揮抗炎作用。

4 中醫(yī)藥聯合BMSC移植干預ESLD的作用

近年來，大量研究[40]集中于如何提高BMSC治療ESLD的臨床效果，常用方法如基因編輯技術、細胞因子或生長因子對BMSC進行預處理，但是基因重編程具有潛在的安全風險。值得關注的是，已有研究[41-42]表明中醫(yī)藥能促進BMSC增殖分化能力，且具有低成本、安全性高的優(yōu)點，有望開發(fā)成為潛在的BMSC移植的輔助治療投入應用。

越來越多研究顯示，中藥復方與BMSC聯用干預ESLD具有協同增效作用。如BMSC聯用一貫煎[43]、鱉甲煎丸[44]、濟生腎氣丸[45]均能改善CCl4誘導的肝硬化大鼠肝功能，減輕肝纖維化，兩者聯用的效果優(yōu)于單用BMSC移植。進一步研究發(fā)現中藥復方及其有效成分可增強BMSC歸巢至受損肝臟并分化為肝細胞的能力。如在CCl4誘導的肝硬化大鼠模型[41]中，柔肝化纖顆粒聯用BMSC移植組肝組織內綠色熒光蛋白標記的BMSC數量明顯多于單用BMSC移植組。體外采用蟲草多糖含藥血清培養(yǎng)大鼠BMSC，發(fā)現蟲草多糖組7天時細胞可見AFP的表達，14天時細胞表達CK18與Alb，提示蟲草多糖能誘導BMSC向肝細胞分化[42]。

課題組前期采用膽管結扎誘導大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，發(fā)現肝臟Notch信號通路活化并促進肝祖細胞向膽管上皮細胞分化，伴隨Notch信號通路的負向調節(jié)因子Numb表達水平降低，阻斷Notch信號可抑制肝纖維化進展[46]。黃芪湯干預可顯著抑制Notch信號的活化及肝纖維化進展，并顯著提高Numb的表達水平[47]。進一步在膽管結扎的同時將BMSC和Numb敲減的BMSC(BMSCNumb-KD)經脾臟注射大鼠肝內，發(fā)現BMSC移植可顯著降低肝組織膠原沉積，并抑制膽管反應和HSC活化，提示BMSC移植可抑制膽汁性肝纖維化進展；而BMSCNumb-KD移植后，可見其主要分化為膽管上皮細胞，促進膽管反應及肝纖維化進展，提示Numb在膽汁性肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。且當BMSCNumb-KD細胞移植后再給予黃芪湯干預，盡管肝纖維化程度有所改善，但Hyp含量、天狼星紅膠原染色陽性面積、α-SMA及CK7、CK19的表達水平等均顯著高于BMSC和黃芪湯單用組，提示Numb可能是黃芪湯抗膽汁性肝纖維化的潛在作用靶點[48]。

5 問題與展望

BMSC及其外泌體治療ESLD具有獨特優(yōu)勢，尤其是大部分臨床試驗均顯示出BMSC移植的安全性與有效性。但仍有一些研究報道在體外培養(yǎng)BMSC時會發(fā)生染色體畸變致瘤[49]，且長期體外培養(yǎng)會降低BMSC增殖與分化能力[50]，尚需開展大樣本的隨機對照臨床試驗提高其臨床研究證據質量。針對BMSC-Ex治療ESLD目前處于基礎研究階段，外泌體內涵物質的定性以及確切的生物學機制仍需進一步解析。值得注意的是，自體BMSC在肝損傷過程中自骨髓中動員并通過外周循環(huán)遷移到損傷肝臟是其發(fā)揮作用的先決條件[51]，如何調動自體BMSC向肝臟歸巢并促進肝組織修復與再生可避免BMSC移植帶來的弊端，是治療ESLD的重要思路。中藥復方及其有效成分可改善肝臟微環(huán)境，而肝臟微環(huán)境對于BMSC向肝臟歸巢及分化能力至關重要。因此深入挖掘中藥復方及其有效成分、如何調動自體BMSC向肝臟歸巢并修復受損肝組織減輕纖維化，是今后極具挑戰(zhàn)和有意義的研究方向。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：梁悅負責收集、分析資料，撰寫論文；胡永紅、劉偉、慕永平參與收集文獻，修改論文；陳佳美負責擬定文章框架，指導撰寫文章并修改稿件；劉平負責擬定文章思路，指導撰寫文章并修改稿件，最后定稿。