T、B淋巴細胞自噬在自身免疫性肝炎患者外周血中的表達及臨床意義

伍慧麗，時紅波，劉燕敏，嚴 艷，王玲玲，丁 美，馬正來，劉 暉，段鐘平

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病科，北京 100069

自身免疫性肝炎(AIH)是由自身免疫反應介導的慢性肝臟炎癥性疾病，近年來發(fā)病呈上升趨勢，臨床特征為血清轉氨酶水平升高、自身抗體陽性、免疫球蛋白G和/或γ-球蛋白血癥，肝組織學上表現(xiàn)為界面性肝炎、漿細胞浸潤等，對免疫抑制治療有效。由于目前AIH發(fā)病機制尚未完全明確，免疫介導途徑尤其是T、B淋巴細胞亞群調節(jié)紊亂導致的肝細胞損傷是目前重要的發(fā)病機制之一。而細胞自噬是真核細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，降解產生的物質可被再利用或者產生能量，因此對于細胞代謝平衡有著重要的作用。近年來淋巴細胞自噬在自身免疫性疾病發(fā)病機制中的作用備受關注，因此針對AIH患者T、B淋巴細胞及自噬的研究是非常有意義且值得探討的方向。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組 所選病例(62例)均來自于2019年10月—2020年10月在本院門診或住院診治的AIH患者，健康對照組8例來自于體檢者。篩選入組標準：按照2015年歐洲肝病學會(EASL)推薦的AIH診斷標準[1]以及1991年國際自身免疫性肝炎小組(IAIHG)評分系統(tǒng)評分[2]，治療前得分高于15分者、治療后得分高于17分者，或者根據(jù)2008年修訂的簡化版評分標準[3]評分大于6分者。臨床診斷為藥物誘的自身免疫性肝炎(DI-AIH)的患者符合Weiler-Normann和Schramm等建立的藥物性肝損傷分類和診斷[4-5]。原發(fā)性膽汁性膽管炎重疊自身免疫性肝炎(PBC-AIH)的診斷符合巴黎診斷標準[6-7]。接受治療的患者給予糖皮質激素和/或免疫抑制劑一線治療標準方案。排除標準：合并各種急慢性肝炎病毒現(xiàn)癥感染(HBsAg陽性或HBV DNA陽性、HCV RNA陽性、HEV IgM陽性、巨細胞病毒或EB病毒核酸陽性)、酒精性肝損傷、脂肪性肝炎、遺傳代謝性肝病等其他原因導致的肝損傷；合并腫瘤以及HIV感染者。肝衰竭患者診斷根據(jù)亞太肝病學會(APASL)[8]和中國《肝衰竭診治指南(2018年版)》[9]，包括急性/亞急性肝衰竭、慢加急/慢加亞急性肝衰竭。肝硬化患者根據(jù)2015年更新的肝硬化循證臨床實踐指南進行診斷[10]。合并PBC患者聯(lián)合使用熊去氧膽酸膠囊每日15～20 mg/kg。

按照經(jīng)一線方案治療4周的療效分為未治療組、治療完全緩解組(ALT及AST、IgG復常)、治療后部分緩解組(ALT、AST及IgG較治療前下降但未完全復常)；按照診斷類型分為特發(fā)性AIH(I-AIH)組、DI-AIH組、PBC-AIH組；按照肝硬化情況分為無肝硬化組、肝硬化代償期組、肝硬化失代償期組；按照肝衰竭情況分為有肝衰竭組和無肝衰竭組。

1.2 各淋巴細胞亞群的LC3B的檢測方法 采集受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝送檢。每份標本事先加入裂解液，后分別加入1 mL血標本充分裂解，離心去上清并PBS洗滌3次，兩試管加入細胞死活染料工作液以及熒光表面抗體CD3、CD4、CD25、CD8a、CD19，避光孵育后加入固定液，最后再加入穿透液，震蕩洗滌穿透共2次，重懸細胞后加入封閉液進行封閉后洗滌細胞，加入LC3B抗體，同樣避光孵育后洗滌，加入穿透液重懸細胞后，加入細胞染色液并上機流式檢測。以平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)表示各淋巴細胞亞群的LC3B的表達水平。

1.3 實驗材料及試劑 Brilliant Violet 605TManti-human CD3、PerCP/Cyanine 5.5 anti-human CD4、Brilliant Violet 421TManti-human CD19、Alexa Fluor?700 anti-human CD8、APC anti-human CD25、DyLightTM488 Donkey anti-rabbit IgG均購自Biolegend公司，LC3B抗體購自Thermofisher公司，裂解液、固定液、穿透液、染色液均購自Biolegend公司。流式細胞儀為Beckman Cytoflex S。

2 結果

2.1 入組患者一般情況 62例AIH患者中男9例，女53例，年齡(53.7±10.8)歲，范圍37～72歲；8例健康對照者中男1例，女7例，年齡(49.7±8.5)歲，兩組年齡、性別均無統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)。

AIH按照診斷類型分為I-AIH 41例、DI-AIH 11例、PBC-AIH重疊綜合征10例；合并肝硬化34例，其中20例為失代償期肝硬化；30例(48.4%)檢測時已接受過糖皮質激素和/或免疫抑制劑治療；53(85.5%)例患者診斷時有明顯的臨床癥狀，主要是納差、尿黃、腹脹、水腫、惡心、嘔吐、發(fā)熱，合并其他自身免疫性疾病的患者有15例，合并糖尿病患者10例(表1)。

表1 AIH患者臨床特點

2.2 T、B淋巴細胞亞群自噬表達 AIH組和健康對照組在T、B淋巴細胞自噬MFI表達上均可見明顯的差別，AIH組CD4+T淋巴細胞自噬MFI、CD8+T淋巴細胞自噬MFI、CD19+B淋巴細胞自噬MFI、CD4+CD25+T淋巴細胞自噬MFI均高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 AIH組與健康對照組T、B淋巴細胞亞群自噬MFI表達

2.3 AIH亞組T、B淋巴細胞亞群自噬表達差異

2.3.1 AIH患者治療對淋巴細胞亞群自噬表達差異的影響 按照是否使用糖皮質激素或免疫抑制劑治療及療效將AIH患者分為3個亞組，結果顯示治療完全緩解的患者CD19+B淋巴細胞LC3B自噬MFI遠高于健康對照組，但顯著低于未治療組和治療部分緩解組(P值分別為0.037、0.040)，而CD4+T、CD8+T以及CD4+CD25+T淋巴細胞自噬MFI在3個亞組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 AIH患者糖皮質激素或免疫抑制劑治療前后T、B淋巴細胞亞群自噬表達

2.3.2 AIH診斷類型與T、B淋巴細胞亞群自噬情況 按照疾病診斷類型將AIH分為3個亞組進行T、B淋巴細胞亞群自噬表達的分析，結果顯示PBC-AIH組CD19+B淋巴細胞LC3B MFI顯著低于I-AIH組和DI-AIH組(P值分別為0.037、0.031)，但是CD4+CD25+T淋巴細胞自噬MFI顯著高于I-AIH組和DI-AIH組(P值分別為0.042、0.044)，而CD4+T以及CD8+T淋巴細胞自噬MFI 3個亞組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表4)。

表4 不同AIH診斷類型與T、B淋巴細胞亞群自噬表達

2.3.3 AIH合并肝硬化淋巴細胞亞群自噬情況 按照是否合并肝硬化將AIH患者分為3個亞組進行T、B淋巴細胞亞群自噬表達的比較，合并代償期肝硬化的患者CD19+B淋巴細胞LC3B MFI顯著低于無肝硬化組和失代償期肝硬化組(P值分別為0.009、0.003)，同時無肝硬化患者CD4+CD25+T淋巴細胞LC3B MFI顯著高于肝硬化組，且與代償期肝硬化組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.037)，而CD4+T以及CD8+T淋巴細胞自噬MFI在3個亞組間均無顯著差異(P值均>0.05)(表5)。

表5 AIH患者肝硬化情況與淋巴細胞亞群自噬表達

2.3.4 AIH合并肝衰竭淋巴細胞亞群自噬情況 按照是否合并肝衰竭情況將AIH患者分為2個亞組進行T、B淋巴細胞亞群自噬表達的比較，結果顯示無肝衰竭組CD19+B淋巴細胞LC3B MFI值雖然明顯高于健康對照組(P<0.01)，但顯著低于有肝衰竭組(P=0.042)；對于CD4+CD25+T淋巴細胞來說，LC3B淋巴細胞自噬MFI值在無肝衰竭組顯著高于有肝衰竭組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.043)(表6)。

表6 AIH患者肝衰竭情況與淋巴細胞亞群自噬表達之間的關系

3 討論

目前研究[11-12]證實機體免疫過程均高度依賴細胞自噬。自噬參與了淋巴細胞的生長、分化、存活和自我平衡并進一步影響機體的免疫過程，是其參與免疫性疾病發(fā)病機制的理論基礎。近年來觀察到自噬參與眾多自身免疫性疾病的發(fā)病機制[13]，而其中有一部分就是淋巴細胞，例如有研究[14-15]顯示活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞自噬相關標志物Beclin1和LC3在基因和蛋白表達水平上均明顯上調，且其增高與血清IFNα水平正相關，說明活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞自噬活性增強可能參與了發(fā)病機制。

從本研究中也同樣觀察到，AIH患者T、B淋巴細胞的自噬水平明顯高于健康人，其中CD19+B淋巴細胞自噬超過20倍的增加，CD4+T、CD8+T也達到了近2倍的增加，CD4+CD25+T淋巴細胞自噬也達到4～5倍的增加，增幅的差異可能與不同淋巴細胞在AIH患者發(fā)病機制中的作用不同有關，比如AIH患者CD4+CD25+T自噬增強明顯，可能與Treg細胞的數(shù)量或功能改變有關，但自噬增加是因還是果尚不清楚。隨后的亞組分析中可看到，在經(jīng)過激素治療完全緩解的患者中CD4+CD25+T自噬水平較健康對照組升高，可見CD4+CD25+T自噬增加很可能是一種保護機制。此外，無肝硬化以及無肝衰竭的AIH患者CD4+CD25+T自噬水平較(失)代償期肝硬化及合并肝衰竭患者顯著升高，從臨床的角度來看，合并失代償期肝硬化的AIH患者往往經(jīng)歷了長期持續(xù)的肝損傷，而肝衰竭的患者往往存在嚴重肝損傷，機體免疫紊亂更為嚴重，因此患者CD4+CD25+T自噬水平下降與疾病的嚴重程度具有相關性。

本研究最顯著的差異是AIH患者CD19+B淋巴細胞自噬的水平顯著上升。既往研究[16]認為B淋巴細胞主要通過產生特異性抗體及提呈抗原，或者與T淋巴細胞相互作用、分泌炎性細胞因子和產生異位生發(fā)中心等正向調節(jié)免疫反應參與自身免疫疾病的發(fā)病，因此B淋巴細胞不但可以參與抗體介導的自身免疫性疾病，也可以參與T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病。AIH以循環(huán)內自身抗體的陽性以及外周血和肝臟組織均有大量B淋巴細胞分化的終末階段漿細胞存在[17]，B淋巴細胞在T輔助淋巴細胞、濾泡樹突狀細胞激活下會產生漿細胞、記憶B淋巴細胞和長壽漿細胞，目前認為持續(xù)的抗原特異性抗體滴度主要來源于長壽漿細胞[18]。因此有理由認為在B淋巴細胞數(shù)量不變的情況下要實現(xiàn)參與AIH的發(fā)病機制就必然有其功能上的改變或者B淋巴細胞各亞群的比例失衡。目前在自身免疫中B淋巴細胞功能障礙的原因尚不完全清楚，直到最近才被發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞代謝可能是決定B淋巴細胞功能是否正常的決定因素[19-20]，而自噬作為細胞代謝的一種表現(xiàn)形式，通過降解并重新利用受損細胞內成分進而修復或改善細胞的功能，在細胞營養(yǎng)缺乏期間維持代謝穩(wěn)定起到重要的作用，尤其在對長壽命漿細胞生存方面起到關鍵性的作用[21-22]。鑒于以上機制，本研究嘗試從臨床角度區(qū)分B淋巴細胞自噬在不同類型AIH患者中的表達和意義，發(fā)現(xiàn)在各亞組中CD19+B淋巴細胞自噬有顯著差異，比如在未治療的疾病活動期AIH患者顯著升高，治療后的AIH患者次之；診斷類型上I-AIH和DI-AIH升高明顯，PBC-AIH次之；無肝硬化和失代償期肝硬化AIH患者升高明顯，代償期肝硬化AIH次之；合并肝衰竭的患者顯著升高，無肝衰竭患者次之。可以看出CD19+B淋巴細胞自噬的表達與疾病的種類、是否治療以及疾病嚴重程度明顯相關，可能是與B淋巴細胞自噬參與細胞代謝影響細胞表達及功能密切相關。

綜上所述，AIH患者T、B淋巴細胞亞群自噬活性明顯上調，以B淋巴細胞自噬上調更為顯著，且與AIH患者診斷類型、是否治療以及疾病嚴重程度明顯相關。對AIH淋巴細胞自噬的活性的研究將為其發(fā)病機制提供新的參考，淋巴細胞自噬的調節(jié)及治療很可能成為今后AIH治療的新思路和新靶點。但是，本研究總體納入的病例數(shù)少，且僅為臨床現(xiàn)象觀察，缺乏更多的基礎及理論研究，其具體作用機制尚缺乏強有力的證據(jù)，故在今后的研究中還需要更深入的探索以及進一步的驗證，擴大樣本量，細化淋巴細胞亞群分類，增加自噬與相關信號通路關系的研究。

倫理學聲明：本研究方案于2019年3月25日經(jīng)由首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會審批，批號：LL-2019-184-K。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：伍慧麗、時紅波、劉燕敏負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉燕敏、嚴艷、王玲玲、丁美、馬正來、劉暉參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；段鐘平負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。