GDF15在腎移植缺血-再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究

朱杰夫 師朗 宋志霞 查宏楚 吳雄飛

腎移植是目前治療終末期腎病的有效方法之一。隨著公民對(duì)逝世器官捐獻(xiàn)認(rèn)知度的不斷提高，腎移植數(shù)量逐年遞增，而移植腎的急、慢性并發(fā)癥可直接影響移植腎的存活，因此倍受關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，20%～40%的腎移植術(shù)后會(huì)出現(xiàn)移植腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF），顯著增加了受者住院時(shí)間和住院費(fèi)用，降低了移植腎的存活率[1-2]。以往認(rèn)為急性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致DGF的主要原因，隨著免疫抑制藥的不斷開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用，近十幾年有了很大程度的改善，但是發(fā)生率仍較高。DGF的另一常見(jiàn)病因?yàn)槟I臟缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），而這一過(guò)程又是器官移植無(wú)法避免的，且目前尚無(wú)有效的干預(yù)措施，因此積極探索IRI的發(fā)生機(jī)制是非常關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題[3-5]。

生長(zhǎng)與分化因子（growth and differentiation factor，GDF）15是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β超家族的一員[6-7]，該超家族成員有助于細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)并激活特異性受體以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞功能[8]。GDF15主要表達(dá)在肝臟和腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中，在腎臟中，GDF15主要表達(dá)于近端小管、Henle環(huán)和集合管[9]。已有研究證實(shí)，GDF15在缺血性疾病、腫瘤、炎癥、心力衰竭等多種病理生理學(xué)過(guò)程中表達(dá)增加，并成為新藥研發(fā)的新靶點(diǎn)[10-12]。例如，血清GDF15水平升高可預(yù)測(cè)手術(shù)或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的發(fā)生率[13-15]，GDF15水平是造影劑腎病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[16]，移植前GDF15水平可以預(yù)測(cè)移植后的不良事件[17]。因GDF15響應(yīng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而表達(dá)和分泌，有研究發(fā)現(xiàn)GDF15敲除小鼠對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的反應(yīng)性增加，其心臟和腎臟組織中單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的表達(dá)較野生型小鼠增加，證明了GDF15在膿毒癥期間的保護(hù)作用，并提出了GDF15為炎癥誘導(dǎo)的介導(dǎo)組織耐受性的蛋白[18-19]。然而在腎移植過(guò)程GDF15表達(dá)如何，是否發(fā)揮生物學(xué)作用，至今國(guó)外內(nèi)均無(wú)報(bào)道。本文主要探討小鼠腎移植IRI過(guò)程中GDF15表達(dá)的變化及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。該動(dòng)物研究方案經(jīng)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)（倫理委員會(huì)）批準(zhǔn)，并經(jīng)三峽大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（202205010T2）。

1.2 模型建立與分組

CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除C57BL/6J小鼠GDF15基因（圖1A），繁殖鼠通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)鑒定野生型以及敲除鼠，并用GDF15蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證敲除效果（圖1B），8～10周齡用于實(shí)驗(yàn)。（1）轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序：野生型供體小鼠9只，野生型受體小鼠9只，分別于術(shù)后4、24、72 h后取3只受體小鼠的移植腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析；（2）取材：野生型供體小鼠5只，GDF15敲除型供體小鼠5只，野生型受體小鼠10只，于術(shù)后72 h提取血清及腎組織樣本；（3）生存率分析：野生型供體小鼠9只，GDF15敲除型供體小鼠9只，野生型受體小鼠18只，觀察腎移植術(shù)后生存率。

小鼠腎移植手術(shù)詳細(xì)描述在既往發(fā)表的文獻(xiàn)[20]，本次研究做了部分修改。麻醉供體小鼠，分離血管，獲取少量血清用于腎功能檢測(cè)，用4 ℃肝素化威斯康星大學(xué)保存液（University of Wisconsin solution，UW液）沖洗雙腎，并在4 ℃ UW液中儲(chǔ)存6 h。麻醉受體小鼠，切除雙腎并移植左腎。移植物吻合時(shí)間固定在30 min，將輸尿管固定到膀胱外壁來(lái)完成植入。獲取供體小鼠血清和右腎作為假手術(shù)對(duì)照組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案將小鼠分為野生型假手術(shù)組、野生型移植組、GDF15敲除假手術(shù)組、GDF15敲除移植組（圖1C）。

圖1 模型建立方法與實(shí)驗(yàn)方案Figure 1 Model building method and experimental scheme

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序 對(duì)各組腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)各組GDF家族基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)表達(dá)情況。

1.3.2 腎功能檢測(cè) 使用7600p Hitachi全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清肌酐和血尿素氮水平。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)各組小鼠腎組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法 將來(lái)自腎臟皮質(zhì)和外髓質(zhì)組織在含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中裂解提取蛋白，取等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。將電泳蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。封閉1 h后，加入稀釋后的GDF15、核因子（nuclear factor，NF）-κB和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光對(duì)印跡進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 免疫組織化學(xué)與免疫熒光染色 將腎組織用石蠟包埋，切成5 μm厚的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)（免疫組化）和免疫熒光染色。腎組織石蠟切片脫蠟后水洗、抗原修復(fù)和封閉。

免疫組化：GDF15、腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）（指示中性粒細(xì)胞）、F4/80（指示巨噬細(xì)胞）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后辣根過(guò)氧化物酶或者堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗孵育，3, 3’-二氨基聯(lián)苯胺或者品紅在顯微鏡控制下染色，用光學(xué)顯微鏡觀察和獲取圖像，呈黃褐色或紅色為陽(yáng)性染色。

免疫熒光：TLR4、NF-κB一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后熒光二抗孵育50 min，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染液孵育5 min，使用熒光淬滅劑封片。在顯微鏡下觀察，Micro Publisher采集圖像。

1.3.6 蘇木素-伊紅染色與腎小管損傷評(píng)分 5 μ m的石蠟切片經(jīng)過(guò)二甲苯和酒精的逐步水化進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，再依次脫水，浸泡二甲苯后，晾干切片，使用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并采集圖片。腎小管損傷表現(xiàn)為腎小管壞死、溶解、擴(kuò)張和管型形成。

腎小管損傷評(píng)分：視野內(nèi)有0～25%損傷小管為1分；視野內(nèi)有26%～50%損傷小管為2分；視野內(nèi)有51% ～75%損傷小管為3分；視野內(nèi)有＞75%損傷小管為4分。所有的切片為隨機(jī)檢查外髓質(zhì)和皮質(zhì)部分，每張切片檢測(cè)10個(gè)視野，取平均計(jì)算腎小管損傷評(píng)分，用顯微鏡拍攝具有代表性的照片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎組織GDF15表達(dá)及病理學(xué)結(jié)果

各組腎組織標(biāo)本測(cè)序結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，GDF15是移植腎轉(zhuǎn)錄組學(xué)中上調(diào)最多的GDF家族基因（均為P＜0.05，圖2）。在腎移植術(shù)后4 h，腎臟中即可檢測(cè)到GDF15蛋白高表達(dá)，且在72 h仍有持續(xù)（圖3A）。免疫組化結(jié)果顯示，GDF15在假手術(shù)組主要在近端小管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，在移植組表達(dá)增加（圖3B）。HE染色結(jié)果顯示，移植組腎小管擴(kuò)張、刷狀緣缺失和管型損傷（圖3C）。

圖2 GDF家族轉(zhuǎn)錄組學(xué)Figure 2 Transcriptome of GDF family

圖3 各組小鼠腎組織GDF15蛋白的表達(dá)情況及病理學(xué)結(jié)果Figure 3 Expression of GDF15 protein and histopathological results of renal tissue in mice of each group

2.2 各組小鼠移植腎功能及術(shù)后病死率

與假手術(shù)組比較，移植組小鼠腎功能下降；與野生型移植組比較，GDF15敲除移植組小鼠血清肌酐、血尿素氮水平升高（均為P＜0.05，圖4A、B）。野生型移植組小鼠術(shù)后1周生存率為87.6%，GDF15敲除移植組術(shù)后1周生存率為41.8%（圖4C）。

圖4 各組小鼠術(shù)后腎功能及生存率Figure 4 Renal function and survival rate of mice in each group after operation

2.3 各組小鼠腎小管損傷情況

免疫組化結(jié)果顯示，GDF15敲除移植組KIM-1表達(dá)更多（圖5A）。HE染色結(jié)果顯示，移植術(shù)后72 h，野生型移植組腎小管可見(jiàn)溶解或壞死，髓外和皮質(zhì)中可見(jiàn)管型形成，而GDF15敲除移植組腎小管壞死及管型更加明顯（圖5B）。GDF15敲除移植組腎損傷評(píng)分更高（均為P＜0.05，圖5C）。

圖5 各組小鼠腎小管損傷情況及腎小管損傷評(píng)分Figure 5 Renal tubular injury and renal tubule injury score of mice in each group

2.4 各組腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，移植術(shù)后72 h，MPO和F4/80在移植腎中表達(dá)升高，且GDF15敲除移植組中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加重（圖6A、B）。ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，移植組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平升高；與野生型移植組比較，GDF15敲除移植組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平升高（均為P＜0.05，圖 6C）。

圖6 各組腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá)情況Figure 6 Inflammatory cell infiltration and expression of inflammatory factors in renal tissues of each group

2.5 各組腎組織TLR4、NF-κB表達(dá)情況

免疫熒光染色結(jié)果顯示，移植組腎組織中TLR4、NF-κB表達(dá)較假手術(shù)組增多；GDF15敲除移植組腎組織中TLR4和NF-κB表達(dá)較野生型移植組增多（圖7）。

圖7 各組腎組織TLR4、NF-κB表達(dá)情況（免疫熒光，×400）Figure 7 Expression of TLR4 and NF-κB in renal tissues of each group

3 討 論

目前，世界范圍內(nèi)對(duì)于器官移植的需求大大超過(guò)了器官供給[4,21]。因此不得不放寬供者選擇標(biāo)準(zhǔn)，如心臟死亡器官捐獻(xiàn)供者，但其通常伴隨著長(zhǎng)時(shí)間的熱缺血和冷缺血[4]。在這種情況下，供者缺血后近端腎小管細(xì)胞的損傷和破壞會(huì)引起急性腎小管壞死，繼而激活炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腎功能進(jìn)一步惡化和組織結(jié)構(gòu)損傷[21-23]。腎臟IRI是導(dǎo)致DGF的重要危險(xiǎn)因素，目前臨床上尚無(wú)特效的藥物用于預(yù)防或治療IRI。GDF15在腎臟中主要表達(dá)于近端小管、Henle環(huán)和集合管，具有參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、激活特異性受體等功能[8-9]。GDF15是一種多效蛋白，在多種復(fù)雜疾病中發(fā)揮重要作用，其作為缺血性疾病的生物標(biāo)志物已成為新藥研發(fā)的新靶點(diǎn)[10-12]，但GDF15對(duì)炎癥的調(diào)控機(jī)制研究還不清楚。本研究利用腎移植IRI模型以及基因敲除手段，發(fā)現(xiàn)腎小管細(xì)胞GDF15在腎臟冷保存移植過(guò)程中被激活，且GDF15激活后可顯著減輕腎移植IRI，促進(jìn)腎功能恢復(fù)。

GDF15與腎移植的關(guān)系臨床研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，GDF15的表達(dá)水平與AKI程度有關(guān)，也是造影劑腎病、慢性腎臟病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[22,24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDF15在移植腎標(biāo)本中升高，主要表達(dá)在腎小管，且GDF15敲除增加了移植小鼠病死率，加重了移植腎IRI。這一發(fā)現(xiàn)為GDF15作為腎移植新治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。值得關(guān)注的是，本研究及既往的實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)GDF15作為疾病進(jìn)展過(guò)程中的炎癥對(duì)抗因子，敲除或者抑制GDF15將加速疾病進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)GDF15敲除后明顯加重移植腎炎性損傷。目前GDF15對(duì)炎癥的調(diào)控機(jī)制研究還不清楚。GDF15能顯著減輕LPS所誘導(dǎo)的膿毒癥，TLR4是LPS最主要的受體[27]。另外有文獻(xiàn)支持，TLR4-NF-κB信號(hào)通路在移植腎IRI中起到關(guān)鍵作用[23,28]?；谏鲜鲅芯?，我們推測(cè)GDF15可能通過(guò)抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用，并使用GDF15敲除鼠進(jìn)一步證實(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GDF15敲除可促進(jìn)移植中TLR4、NF-κB的表達(dá)，提示供體來(lái)源的GDF15具有抑制炎癥的作用。因此，GDF15減輕移植腎IRI可能與抑制TLR4-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，但更為深入的分子生物機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

目前世界各研究機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)已針對(duì)GDF15為靶點(diǎn)進(jìn)行了藥物研究，涉及肥胖、腫瘤及厭食綜合征等領(lǐng)域，利用其激活或抑制作用開(kāi)發(fā)了各類(lèi)藥物，如GDF15類(lèi)似物、GDF15融合蛋白、GDF15單克隆抗體、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族α樣受體（glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor alpha-like，GFRAL）拮抗劑單克隆抗體等[29-30]，處于臨床前或I期臨床試驗(yàn)等不同階段[11,25]。例如GDF15 Fc融合蛋白（AMG-171）治療代謝綜合征已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)（NCT04199351）；美國(guó)強(qiáng)生公司研發(fā)了GDF15受體GFRAL激動(dòng)劑JNJ-9090，可通過(guò)促進(jìn)產(chǎn)熱、脂解以及氧化代謝發(fā)揮抗肥胖作用。GDF15相關(guān)藥物對(duì)腎移植IRI的作用值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究建立了與臨床移植過(guò)程更為貼合的小鼠腎移植模型，并利用基因敲除，首次發(fā)現(xiàn)GDF15是移植后腎小管損傷的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)劑，可影響腎移植炎癥反應(yīng)。本研究為腎移植IRI提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為今后找尋腎移植IRI的干預(yù)靶點(diǎn)提供參考。