不同紅曲菌株對多糖飲料品質的影響

況嘉鈾，李瑩瑩，鄭平，吳紫婷，劉棗*，王偉平

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

多糖是一類由多個相同或不同類型單糖以糖苷鍵方式結合而成的高分子碳水化合物，廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中，具有可以激活人體免疫細胞[1]、誘導癌細胞凋亡[2]、清除自由基[3]和降低血糖、血脂[4]等生物活性[5]。且多糖可以影響風味物質的釋放，風味物質相對濃度增加，從而使多糖產(chǎn)品具有更好的感官品質[6]，因此多糖越來越多地被應用于飲料的研制。目前，市場上大部分的多糖飲料是通過添加植物提取得到的多糖制備而成，而發(fā)酵多糖飲料產(chǎn)品較少。

紅薯是一種營養(yǎng)豐富的天然滋補食品，富含蛋白質、多糖、多種維生素等，對促進人體腸道消化，增強人體免疫力起著重要作用[7]。我國紅薯種植面積為7500萬畝～8 000萬畝，資源豐富。紅曲菌是一種具有較高食用和藥用價值的絲狀真菌，可以產(chǎn)生紅曲色素、紅曲多糖、monacolin K、γ-氨基丁酸等多種功能活性物質，還能產(chǎn)生天然色素和酸、醇、酯等豐富的風味物質[8]，其中紅曲色素是一種天然可食用色素，廣泛地應用于食品領域[9]。紅曲多糖是一種真菌多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖通過β-1，3糖苷鍵組成，具有抗腫瘤、提高免疫力等生物功能。紅曲菌產(chǎn)生的其他代謝物質還具有降血壓、降血脂等作用，在抗癌、抗疲勞、防治骨質疏松等方面也有一定功效[10]。紅曲菌還可產(chǎn)生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亞油酸乙酯等風味物質，這些風味物質能夠賦予紅曲產(chǎn)品豐富的香味[8]。紅曲菌不僅可以產(chǎn)生多種活性物質還能產(chǎn)生多種風味物質，可用作發(fā)酵飲料的菌種。

不同紅曲菌代謝能力及產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力存在明顯差異[11-14]。本文以實驗室3株紅曲菌Monascus GN、H4000和Z505為研究對象，以新鮮紅薯為原料，研究不同菌株液態(tài)發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲色素、紅曲多糖等代謝產(chǎn)物能力，對發(fā)酵液進行感官評分，篩選得到優(yōu)良菌株，為以后制備紅薯紅曲多糖飲料的研究提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅曲菌（Monascus）GN、Z505、H4000：湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室保藏。

新鮮紅薯：市售；葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨（分析純）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂（分析純）：武漢市華順生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器（GI65DWS）：致微（廈門）儀器有限公司；垂直流超凈工作臺（ZGJH-1214）、雙層特大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2112B）：上海智城分析儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052）：上海精宏試驗設備有限公司；高速冷凍離心機（Fresco 17）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；可見光分光光度計（722S）：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖6%、蛋白胨2%、可溶性淀粉3%、瓊脂3%，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：新鮮紅薯洗凈去皮，切成1 cm3的方塊。新鮮紅薯塊10%、葡萄糖2%、蛋白胨0.6%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.2%，搖瓶培養(yǎng)，裝液量為200 mL/500 mL，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：新鮮紅薯洗凈去皮，切成1cm3的方塊。新鮮紅薯塊20%、葡萄糖2%、酵母粉0.14%、蛋白胨0.8%、KH2PO40.1% 、MgSO4·7H2O 0.05% 、ZnSO40.1% 、CaCO30.1%，裝液量為100 mL/250 mL，121℃滅菌20 min。

1.4 方法

1.4.1 紅薯紅曲多糖飲料工藝流程

紅曲菌→菌種活化→液體二級種子→接種發(fā)酵培養(yǎng)基→發(fā)酵→過濾除菌→后熟→調配→巴氏滅菌→灌裝→檢驗→成品。

1）菌種活化：將3種紅曲菌株分別接種到配制好的斜面培養(yǎng)基上，于30℃下恒溫培養(yǎng)1周左右。

2）液態(tài)種子培養(yǎng)：用接種環(huán)在長好的斜面培養(yǎng)基中刮取兩環(huán)接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)2 d。

3）接種：將冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基接入體積分數(shù)為10%的二級種子液。

4）發(fā)酵：將接種后的培養(yǎng)基置于30℃、200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)6 d。

5）過濾除菌：將發(fā)酵后的紅曲菌發(fā)酵液經(jīng)過濾得到過濾液，再將過濾液4 000 r/min離心10 min得到上清液。

6）低溫后熟：將過濾離心得到的上清液轉移到干凈的玻璃瓶中，封口，置于4℃冰箱進行低溫后熟。

7）調配：對低溫后熟后的產(chǎn)品進行產(chǎn)品調配，使產(chǎn)品符合國家標準GB/T 10789—2015《飲料通則》（含第1號修改單）。

8）巴氏滅菌、灌裝：將低溫后熟經(jīng)調配的紅曲菌發(fā)酵飲料進行巴氏滅菌，并進行灌裝。

9）成品、檢驗：對發(fā)酵飲料進行感官評分、理化及微生物指標的檢測。

1.4.2 pH值的測定

發(fā)酵液pH值采用pH計測定。

1.4.3 紅曲色價的測定

移取1 mL發(fā)酵液加入9 mL 70%的乙醇溶液，置于60℃恒溫搖床中，180 r/min萃取1 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋至適宜倍數(shù)，在410、470、505 nm處分別測定紅曲黃色素、紅曲橙色素、紅曲紅色素3種色素的吸光值。計算公式如下[15]。

紅曲色素的色價/（U/mL）=吸光值×稀釋倍數(shù)

1.4.4 紅曲多糖的測定

取過濾后的濾液5 mL，加入3倍體積的無水乙醇，在4℃醇沉48 h，取出后4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，在50℃烘箱烘干至恒重，加入蒸餾水溶解并定容至50 mL，取0.5 mL上述溶液加入1.5 mL蒸餾水，加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再加入5 mL濃H2SO4，振蕩搖勻，在沸水浴中反應15 min，迅速冷卻，測定490 nm處吸光值[16]。

1.4.5 桔霉素的測定

桔霉素測定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，取上清液 5 mL，加入10 mL的無水乙醇，在60℃恒溫搖床中200 r/min萃取1 h，在8 000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，即得待測液。

HPLC條件：流動相為超純水（用磷酸調pH值至2.5）∶乙腈=50∶50（體積比）；熒光發(fā)射波長為 331 nm，激發(fā)波長為500 nm；色譜柱為EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；體積流量為 1 mL/min；柱溫 28 ℃；上樣量（標準品及樣品）均為20 μL。

1.4.6 感官評分方法

參考劉琨毅等[17]的方法并稍作修改，選擇10名評分員組成感官評分小組，對紅曲菌發(fā)酵液的色澤、組織狀態(tài)、香氣等方面進行評分。產(chǎn)品評分在常溫下進行，并采取隨機編碼形式。評分時需給予評分員充足的時間，并在評分的過程中不斷呼吸新鮮空氣以保證評分結果不被外來混雜氣味所干擾。感官評分內容和標準見表1，由10人評分后取平均值。總分=色澤外觀×40%+香氣×60%。

表1 感官評分Table 1 Sensory evaluation

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗設置3個重復，每個單因素試驗進行3次平行試驗。試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進行制圖，并利用SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析和顯著性t檢驗，結果通過平均值±標準差表示，P＜0.05為顯著性差異，P＞0.05為不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同紅曲菌種發(fā)酵最終pH值的對比分析

不同菌種發(fā)酵的最終pH值結果見圖1。

從圖1中可以得出不同紅曲菌發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)酸的代謝能力差別不顯著（P＞0.05），紅曲菌GN的產(chǎn)酸能力相對較強，其發(fā)酵最終pH值為5.00，紅曲菌Z505和紅曲菌H4000產(chǎn)酸能力較為接近，分別為5.42和5.32。導致紅曲發(fā)酵液呈現(xiàn)酸性的主要因素為有機酸，其中，乳酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸和酮戊二酸是紅曲發(fā)酵液中的主要有機酸，占總量的87%左右。紅曲菌產(chǎn)酸的能力主要與淀粉酶和糖化酶相關[18]，與培養(yǎng)基中無機鹽的種類和添加量也有一定的相關性[19-20]。產(chǎn)淀粉酶以及糖化酶較強的紅曲菌能更多地利用底物原料，產(chǎn)生各種初級代謝產(chǎn)物以及次級代謝產(chǎn)物，發(fā)酵液中各物質的差異性導致了不同紅曲菌在發(fā)酵過程中的pH值存在一定差異。其中紅曲菌GN的最終pH值低于紅曲菌Z505和H4000，可能是由于紅曲菌GN能夠產(chǎn)生較多的淀粉酶和糖化酶消耗了更多的底物原料所導致的。以農(nóng)產(chǎn)品為發(fā)酵原料時，農(nóng)產(chǎn)品在發(fā)酵過程中具有良好的pH緩沖性[21]。因此，在以新鮮紅薯為原料時，不同菌種對發(fā)酵最終pH值的影響不明顯。

2.2 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的對比分析

不同的菌株產(chǎn)色素能力不同[22-24]。不同菌種發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲色素的結果見圖2。

由圖2可知，紅曲菌GN產(chǎn)紅曲色素的能力較強，顏色呈深紅色，紅曲色價為239.1 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為 99.1、55.8、84.2 U/mL；紅曲菌H4000產(chǎn)紅曲色素的能力相對較弱，顏色呈橘黃色，紅曲色價為48.8 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為14.8、8.8、25.2 U/mL；紅曲菌Z505在這3株紅曲菌中產(chǎn)色素能力最弱，顏色呈橙黃色，色價為29.5 U/mL，其紅曲紅色素、橙色素、黃色素的色價分別為9.4、4.2、15.9 U/mL。紅曲色素的質量和產(chǎn)量主要受碳源、氮源、發(fā)酵溫度、pH值、色素疏水性等因素的影響，此外，菌種的差異性也會導致紅曲色素的質量和產(chǎn)量存在較大差異性。周珂等[25]利用紫色紅曲菌ZH2液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的主要為橙色素和黃色素，其橙色素和黃色素分別為152.96、108.38 U/mL。黎青華等[26]通過誘變育種獲得的紅曲菌突變株LBBE-15主要產(chǎn)紅色素，其紅曲紅色價達到1 244 U/mL。本試驗篩選出的3株紅曲菌株的發(fā)酵液顏色呈現(xiàn)出不同的顏色，且紅曲色價均不同，這是菌種的差異性導致的。因此可以針對不同要求，選用不同的發(fā)酵菌種進行不同產(chǎn)品的研發(fā)。

2.3 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)紅曲多糖的對比分析

不同紅曲菌株發(fā)酵新鮮紅薯產(chǎn)紅曲多糖的結果見圖3。

由圖3可知，紅曲菌菌株Z505、GN與紅曲菌菌株H4000產(chǎn)紅曲多糖的能力存在顯著差異（P＜0.05），其中紅曲菌Z505產(chǎn)紅曲多糖的能力最強，其紅曲多糖的含量為1.89 g/L，其次是紅曲菌GN和紅曲菌H4000，其紅曲多糖含量分別為1.75g/L和1.18g/L。目前通過培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝優(yōu)化，得到的紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲多糖含量一般為1 g/L左右[16]。大部分多糖飲料由于原料來源或制作方法的不同多糖含量差別較大，多糖飲料的含量多為 0.1 g/L～10.0 g/L[5，27-29]。本研究中 3 株紅曲菌的紅曲多糖含量均達到了1g/L以上，表明這3株紅曲菌產(chǎn)紅曲多糖能力較強，可進一步優(yōu)化培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝使紅曲多糖的產(chǎn)量得到提高。

2.4 不同紅曲菌種發(fā)酵產(chǎn)桔霉素的對比分析

不同紅曲菌株發(fā)酵后上清液的桔霉素檢測結果見圖4。

由圖4可知，紅曲菌菌株Z505、H4000與紅曲菌菌株GN產(chǎn)桔霉素的能力存在顯著差異（P＜0.05）。紅曲菌GN上清液中的桔霉素濃度為0.45 mg/L，紅曲菌H4000上清液中的桔霉素濃度為0.23 mg/L，紅曲菌Z505上清液中的桔霉素濃度為0.10 mg/L。有研究報道，可以通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的物理環(huán)境因素或添加外源添加物來控制菌絲生長，影響代謝途徑，從而達到降低桔霉素的目的[30]。本研究發(fā)酵周期為6 d，桔霉素濃度隨發(fā)酵周期的延長也會發(fā)生變化，通過培養(yǎng)基優(yōu)化以及工藝優(yōu)化可進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝降低桔霉素濃度，使最終紅曲多糖發(fā)酵飲料中不含有桔霉素。

2.5 不同菌種的感官評分結果

不同紅曲菌發(fā)酵過濾液的感官評分的結果見圖5。

由圖5可知，與紅曲菌GN和H4000相比，紅曲菌Z505的感官評分具有顯著性差異（P<0.05），紅曲菌Z505的感官評分（83分）最高，這可能是由于紅曲菌Z505能夠產(chǎn)生較好酸、醇、酯等香味物質；紅曲菌GN與H4000的感官評分均為74。通過對比發(fā)現(xiàn)紅曲菌GN發(fā)酵過濾液顏色較深，具有花香但也有較重的異味，所以評分較低；紅曲菌H4000顏色偏橘黃色，較為透亮，但有異味，故感官評分較低；紅曲菌Z505發(fā)酵過濾液雖然顏色較其他兩株菌顏色淺，但色正，透亮，且具有怡人的花果香味，因此紅曲菌Z505的評分最高。多糖可以通過改變食品質構或者多種作用力與風味物質分子結合來影響風味物質的擴散及保留[6，31]，風味物質與多糖的親和力越強，越容易發(fā)生相互作用，從而越容易得到保留。本試驗中由紅曲菌Z505發(fā)酵得到的胞外多糖為1.89 g/L，其感官評分也相對最高，表明多糖對香味物質的保留以及擴散具有一定的正相關性。

3 討論與結論

紅曲菌產(chǎn)生的紅曲多糖可以影響風味物質的釋放，使飲料產(chǎn)品具有更好的感官品質，紅曲菌發(fā)酵還能產(chǎn)生苯乙醇、辛醇、2-壬酮、亞油酸乙酯等風味物質賦予紅曲產(chǎn)品良好的風味，除此之外，紅曲菌產(chǎn)生的紅曲黃色素、橙色素、紅色素，能夠賦予發(fā)酵飲料顏色，產(chǎn)生的monacolin K、γ-氨基丁酸等多種功能活性物質賦予其功能性，紅薯是一種營養(yǎng)豐富的食品，所以利用紅曲菌發(fā)酵紅薯制備紅薯紅曲多糖飲料有一定的前景。

不同紅曲菌株產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力存在明顯差別，本研究對比分析 3 株紅曲菌（Z505、H4000、GN）液態(tài)發(fā)酵紅薯研制多糖飲料在pH值、紅曲色素、紅曲多糖、桔霉素以及感官評分的差異性，結果表明3株紅曲菌發(fā)酵結束時的pH值無明顯差異，紅曲菌株Z505產(chǎn)紅曲多糖的能力最強，為1.89 g/L，桔霉素含量最低，發(fā)酵上清液色澤橙黃透亮，感官評分最好，散發(fā)著花果香味，適合進一步用于紅薯紅曲多糖飲料方面的研制。