甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

李盼盼，楊勝祥，龐林江，陸國(guó)權(quán)

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)光機(jī)電工程學(xué)院，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

酪氨酸酶是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含二價(jià)銅離子的金屬酶，可催化L-多巴形成多巴醌，最終氧化生成黑色素，其廣泛存在于動(dòng)植物、微生物以及人體中，與果蔬酶促褐變和人體皮膚黑色素的形成密切相關(guān)[1]。人體因受到紫外線照射等影響，導(dǎo)致黑色素分泌增加，從而產(chǎn)生黑色素瘤等疾病[2]。在植物性食品中，酪氨酸酶可以催化植物酚類化合物氧化生成醌類化合物，使水果和蔬菜內(nèi)部或表面產(chǎn)生酶促褐變，嚴(yán)重影響水果和蔬菜的外觀和質(zhì)量，降低其貯藏時(shí)間。酪氨酸酶抑制劑在化妝品及食品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[3]，而常見的酪氨酸酶抑制劑如對(duì)苯二酚、熊果苷、L-抗壞血酸、鞣花酸、曲酸等在應(yīng)用上表現(xiàn)出多種弊端，譬如對(duì)細(xì)胞潛在誘變性、皮膚接觸不良反應(yīng)、不穩(wěn)定性、生物利用性低，甚至表現(xiàn)出致癌性被禁用[4]。越來(lái)越多的研究表明，植物中存在的一些活性成分對(duì)酪氨酸酶的活性有抑制作用，且在應(yīng)用上比人工合成的酪氨酸酶抑制劑安全性更高，這些天然植物活性成分多數(shù)是一些高等植物在次級(jí)代謝過程中的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，多酚和黃酮類化合物就是其中的一種，且有關(guān)于黃酮類物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶活性有抑制作用的研究也越來(lái)越多。自然界中豐富多彩的物種資源為研究提供了大量的試驗(yàn)材料，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)為酪氨酸酶抑制劑篩選開辟了新途徑[5]。吳穎等[6]研究發(fā)現(xiàn)，桔梗、金盞菊、蒲公英、銀杏葉和茶葉5種植物提取物對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。許蘭等[7]的研究表明，茶樹花提取物可以抑制酪氨酸酶活性，減少黑色素生成，達(dá)到美白效果。Chang 等[8]、Yang 等[9]的研究表明，桑樹枝、根皮部及桑葉提取物可以抑制酪氨酸酶活性。Gheibi等[10]的研究表明，黃酮衍生物能夠可逆地抑制多巴與酪氨酸酶活性位點(diǎn)的結(jié)合。Bendaikha等[11]的研究表明，黃花中分離出的黃酮苷類化合物可以抑制酪氨酸酶活性。

甘薯葉主要含多酚類、黃酮類化合物等多種活性成分，但目前關(guān)于甘薯葉的研究，主要集中在其提取物活性成分的抗氧化功能方面，甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用方面的研究鮮見。若能將甘薯葉應(yīng)用于食品和化妝品中或?qū)⑻岣咂湔w資源價(jià)值[12]。本試驗(yàn)采用不同極性溶劑提取甘薯葉中的活性成分，研究提取獲得的甘薯葉活性成分對(duì)酪氨酸酶活性的影響，初步探究甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理，為甘薯葉進(jìn)一步開發(fā)并應(yīng)用于功能食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯葉：浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)薯博園；酪氨酸酶（≥1 560 U/mg）：北京酷爾化學(xué)科技有限公司；L-多巴（標(biāo)準(zhǔn)品）、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；石油醚（沸程60℃～90℃）、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A）：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；多功能粉碎機(jī)（YB-150）：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；智能超聲波清洗器（DL-400B）：上海之信儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（Biosafer-10C）：賽飛（中國(guó)）有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-215）：瑞士BUCHI實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯葉不同溶劑提取物樣品制備

樣品制備參考邱珊蓮等[13]的方法并稍作修改。將甘薯葉洗凈，60℃烘干，粉碎并過80目篩，按照料液比1∶50（g/mL）加入80%乙醇，在55℃條件下超聲輔助提取3次，每次50 min，合并提取液。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的一半后，加入3倍～4倍體積的無(wú)水乙醇靜置24 h，醇提液過濾，濃縮，真空冷凍干燥。將醇提物用水溶解，分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，分別得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相。將不同溶劑提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，并配制成不同質(zhì)量濃度的抑制劑，備用。

1.3.2 酪氨酸酶抑制率及酶活力測(cè)定

參考張洪梅[14]的方法，通過測(cè)定酪氨酸酶催化L-多巴氧化速率，分別考察甘薯葉乙醇提取物及不同溶劑提取物對(duì)體外酪氨酸酶的抑制作用。酪氨酸酶活力以催化L-多巴氧化反應(yīng)生成多巴醌的二酚酶活力來(lái)衡量。具體操作：試管中加入酪氨酸酶（50 U/mL）0.5 mL，pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）2.5 mL，于37℃水浴10 min，加入0.1 mg/mL的L-多巴溶液0.5 mL，混合均勻后立即計(jì)時(shí)。在475 nm處測(cè)定光密度值（A475）隨時(shí)間的變化曲線，酪氨酸酶活力單位(U/min)規(guī)定以每分鐘A475增加0.001為1個(gè)酶活力單位表示，酶促反應(yīng)的速度用每分鐘A475增加值來(lái)表示，反應(yīng)體系組成見表1，酶抑制率及相對(duì)酶活力公式如下所示。

表1 反應(yīng)體系組成Table 1 Composition of reaction system mL

式中：A1為無(wú)提取物有底物時(shí)的吸光度；A2為無(wú)提取物無(wú)底物時(shí)的吸光度；A3為有提取物有底物時(shí)的吸光度；A4為有提取物無(wú)底物時(shí)的吸光度。

1.3.3 酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

參考盛曉笑等[15]及馬燕燕等[16]的方法研究甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效應(yīng)，通過固定底物L(fēng)-多巴濃度，改變加入酶溶液的濃度，考察不同質(zhì)量濃度甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響。為進(jìn)一步研究甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)，通過固定酪氨酸酶液濃度，改變底物L(fēng)-多巴溶液的濃度，并加入不同質(zhì)量濃度的甘薯葉提取物，以底物L(fēng)-多巴溶液濃度倒數(shù)1/[S]、反應(yīng)初速度倒數(shù)1/v為指標(biāo)，并按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程進(jìn)行擬合。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 22.0和Origin 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理，采用Adobe Photoshop 2021進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.1.1 甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活力的影響

不同質(zhì)量濃度甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率見圖1。

底物L(fēng)-多巴在酪氨酸酶的催化作用下產(chǎn)生多巴醌，多巴醌自動(dòng)氧化生成多巴色素，反應(yīng)體系顏色越深，色素生成物濃度越大[17]。由圖1可知，隨著甘薯葉乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸酶催化底物L(fēng)-多巴生成色素產(chǎn)物的量逐漸減少，酪氨酸酶活力逐漸下降，當(dāng)甘薯葉乙醇提取物質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL時(shí)，酪氨酸酶抑制率達(dá)到61.43%，因此可看出甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。根據(jù)甘薯葉乙醇提取物質(zhì)量濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的擬合曲線可得半抑制濃度IC50約為5.53 mg/mL。

2.1.2 甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的進(jìn)程曲線及相對(duì)酶活力見圖2。

由反應(yīng)進(jìn)程曲線可看出，不同質(zhì)量濃度甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率趨勢(shì)是一致的。隨著乙醇提取物質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)生成的多巴色素的量越來(lái)越少，酶促反應(yīng)受到抑制，且抑制強(qiáng)度隨乙醇提取物質(zhì)量濃度增加逐漸加大，反應(yīng)15 min后反應(yīng)生成物的量不再增加，底物已消耗完全，酶促反應(yīng)基本結(jié)束。由相對(duì)酶活曲線可知，隨著抑制劑質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸酶活力逐漸下降，當(dāng)乙醇提取物質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL時(shí)，酪氨酸酶相對(duì)酶活力下降至38.57%。

2.2 甘薯葉不同溶劑萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率

不同溶劑萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率結(jié)果見圖3。

由圖3可知，不同極性萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率差異很大，甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最明顯，抑制率達(dá)50%，這與李俊強(qiáng)等[18]的研究中1 mg/mL的甘草正丁醇層對(duì)酪氨酸酶抑制率大致相同。水層物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶抑制作用最弱，可能因?yàn)樗畬邮且恍┑鞍踪|(zhì)及黏性多糖類物質(zhì)，活性物質(zhì)含量較少[19]，對(duì)酪氨酸酶活性無(wú)影響。同質(zhì)量濃度的甘薯葉石油醚層、三氯甲烷層與乙酸乙酯層物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶抑制率約為正丁醇層抑制率的5%～35%，說(shuō)明了甘薯葉中對(duì)酪氨酸酶有抑制作用的活性物質(zhì)主要在正丁醇層。

2.3 甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性影響的進(jìn)程曲線及抑制率曲線結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著正丁醇萃取物質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸酶抑制率逐漸增大，當(dāng)正丁醇萃取物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，酪氨酸酶抑制率可達(dá)68.57%。與10.0 mg/mL甘薯葉乙醇提取物相比，酶抑制率明顯提高，這說(shuō)明了以正丁醇為提取劑比乙醇能更多的富集對(duì)酪氨酸酶有抑制作用的活性物質(zhì)。根據(jù)甘薯葉正丁醇萃取物質(zhì)量濃度對(duì)酪氨酸酶抑制率的擬合曲線可知IC50約為4.01 mg/mL。

2.4 甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶抑制的動(dòng)力學(xué)分析

2.4.1 甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制類型判斷

甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的類型判斷結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著甘薯葉正丁醇萃取物質(zhì)量濃度的增加，酪氨酸酶活力逐漸下降。當(dāng)體系中加入不同質(zhì)量濃度的甘薯葉正丁醇萃取物時(shí)，酶濃度曲線均呈現(xiàn)為通過原點(diǎn)的直線，且直線的斜率隨著甘薯葉正丁醇萃取物質(zhì)量濃度的增加而逐漸減小，這說(shuō)明了甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過程，即甘薯葉提取物是通過與酪氨酸酶的某些必需基團(tuán)以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，從而抑制了酪氨酸酶的催化活力，導(dǎo)致催化速率的下降，但這種結(jié)合形式并不會(huì)直接使酶分子的構(gòu)象發(fā)生永久性的失活[20-21]。因此，可以明確說(shuō)明甘薯葉提取物抑制酪氨酸酶的作用是可逆性抑制。

2.4.2 甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)

甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk圖見圖6，甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的米氏方程見表2。

表2 甘薯葉正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的米氏方程Table 2 Michaelis equation of the inhibitory effect of n-butanol extract from sweet potato leaves on tyrosinase activity

由圖6可知，雙倒數(shù)圖為相交于第二象限的一組直線，且直線斜率、縱截距與無(wú)抑制劑組相比均隨抑制劑質(zhì)量濃度的增加而增大，且由表2米氏方程可知，隨抑制劑質(zhì)量濃度增加，表觀米氏常數(shù)Km增加，最大反應(yīng)速率Vmax減小，這符合非競(jìng)爭(zhēng)性與競(jìng)爭(zhēng)性混合的抑制類型特征[22]，即甘薯葉提取物可以同時(shí)與游離酶和酶-底物L(fēng)-多巴絡(luò)合物作用。將米氏方程斜率、縱截距分別對(duì)抑制劑質(zhì)量濃度二次作圖，如圖7、圖8所示。

由圖7、圖8直線斜率可求得甘薯葉提取物與游離酶的解離常數(shù)KI和甘薯葉提取物與酶-底物絡(luò)合物的解離常數(shù)KIS分別為0.198、0.209 mg/mL，由此可知甘薯葉提取物與游離酶的結(jié)合程度明顯大于與酶-底物絡(luò)合物的結(jié)合。

3 討論與結(jié)論

本文研究結(jié)果表明甘薯葉中存在抑制酪氨酸酶的活性成分，甘薯葉提取物可進(jìn)一步應(yīng)用于功能性食品開發(fā)以及預(yù)防和治療色斑疾病的藥物開發(fā)等方面。甘薯葉乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用可達(dá)61.43%，根據(jù)其活性成分的極性的不同，采用不同極性萃取劑依次進(jìn)行萃取，可以得到石油醚層、三氯甲烷層、乙酸乙酯層、正丁醇層及水層物質(zhì)，進(jìn)一步研究不同萃取層物質(zhì)的酶抑制作用，結(jié)果表明正丁醇層物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)，且與同質(zhì)量濃度的甘薯葉乙醇提取物相比，正丁醇萃取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用更強(qiáng)，說(shuō)明正丁醇溶劑能將甘薯葉中抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)更多的富集起來(lái)。進(jìn)一步研究其對(duì)酪氨酸酶的抑制類型發(fā)現(xiàn)，甘薯葉正丁醇層物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過程，即甘薯葉正丁醇層物質(zhì)與酶的作用并不會(huì)引起酶的分子構(gòu)象的改變，即正丁醇溶劑萃取出的甘薯葉中的活性成分與酪氨酸酶分子是以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，但甘薯葉中的活性物質(zhì)與酶分子的結(jié)合部位是否為酶分子的活性中心還需進(jìn)一步研究。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程擬合結(jié)果可知，Km增加，Vmax減小，甘薯葉正丁醇層物質(zhì)對(duì)酪氨酸酶的作用是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制與競(jìng)爭(zhēng)性抑制混合的結(jié)果，且甘薯葉提取物與游離酶的解離常數(shù)KI小于甘薯葉提取物與酶-底物絡(luò)合物的解離常數(shù)KIS，即甘薯葉提取物與游離酶的結(jié)合程度明顯大于與酶-底物絡(luò)合物的結(jié)合。

酪氨酸酶抑制劑可以應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)、化妝品原料的篩選、農(nóng)作物的病害蟲防治以及醫(yī)療等領(lǐng)域，但由于目前常用的酪氨酸酶抑制劑藥物常出現(xiàn)不良反應(yīng)，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始將目光投入到天然酪氨酸酶抑制劑的研究與開發(fā)上，尋求特異性更好、效果更顯著且安全性更高的酪氨酸酶抑制劑，研究抑制機(jī)理、抑制動(dòng)力學(xué)及抑制劑應(yīng)用。甘薯葉屬于甘薯加工中的副產(chǎn)物，但往往被丟棄在田間地頭，事實(shí)上甘薯葉中富含多種活性成分，而這些活性成分的研究?jī)r(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超乎想象，合理利用甘薯葉資源，發(fā)揮其更多的研究作用，提高甘薯葉的綜合利用率，拓展甘薯產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)空間。本研究表明了甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶有抑制作用，但其提取物中的具體有效成分還不確定，今后可對(duì)甘薯葉提取物中的有效成分進(jìn)行分離鑒定，研究其單體化合物對(duì)酪氨酸酶活性的影響，從而明確甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的主要成分，并考察提取物對(duì)皮膚的刺激性，為今后甘薯葉的深加工利用提供理論依據(jù)。另外，甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶分子的影響部位還不明確，后續(xù)可深入研究甘薯葉提取物與酶分子的結(jié)合部位，進(jìn)一步明確甘薯葉提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的機(jī)理。