食品微生物檢測中PCR 技術的應用探索

周宇晨，耿思緣，宋春璐，夏元鳳，潘玉愛

（大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測研究院有限公司，遼寧大連 116000）

隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，由微生物引起的食品安全事件頻發(fā)，個別食品廠商為了盲目追求經(jīng)濟效益而忽略了食品微生物檢測質(zhì)量。因此在現(xiàn)階段加強食品微生物檢測質(zhì)量變得十分重要，PCR 技術具有十分重要的技術應用價值，在全國各地具有比較廣泛的應用[1]。

1 常見PCR 技術類型分析

PCR 技術的又叫聚合酶鏈式反應技術，初見于20 世紀80 年代中期，也被稱之為基因體外擴增檢測技術。應用過程中，針對靶NDA 雙鏈進行加熱變形，將其轉化為單鏈結構，靶DNA 兩端正鄰近序列互補的寡核苷酸片段分為左端引物、右端引物，與互補DNA 單鏈堿基形成互補結合反應。在4 種dNTPs 底物以及DNA 聚合酶共存的情況下，這些引物會在模板DNA 鏈中逆時針進行延伸，并形成新DNA 雙鏈，在循環(huán)反復幾十次的反應后，可使靶DNA 序列擴增數(shù)百萬倍，在食品微生物檢測領域中體現(xiàn)出了較高的應用價值。就目前來看，現(xiàn)階段的PCR 檢測方法在以下幾種技術中有較多的應用。

1.1 多重PCR 技術

和以往所用的傳統(tǒng)PCR 技術比較類似，然而多重PCR 技術在相同的反應體系中，與傳統(tǒng)PCR 技術相比多了一對或多對特異性引物，這些引物特異性互補模板共存條件下，可以從相同反應罐中擴增出相應數(shù)量的DNA 片段。多重PCR 技術實質(zhì)上屬于在傳統(tǒng)PCR 技術的完善與發(fā)展下所形成的新型PCR擴增技術，可以在食物微生物檢測過程中，將多種種類、數(shù)量的微生物得以有效檢測出來，具有比較廣泛的應用[2]。

1.2 實時定量PCR 技術

實時定量PCR 技術屬于一種新型PCR 技術，不僅可以有效體現(xiàn)出PCR 技術的靈敏度與便捷性，還可以解決常規(guī)PCR 技術在應用過程中可能出現(xiàn)的假陽性污染問題，顯著提高定量檢測準確性效果，同時具有良好的重復性與低廉的費用成本。與傳統(tǒng)PCR 技術的基本原理不同，定時定量PCR 技術在應用過程中，以熒光染料、探針來促進擴增特異性發(fā)展，熒光信號強弱與擴增產(chǎn)物量形成正比例關系，對保障定量檢測的準確性具有重要意義。

1.3 PCR-ELISA 技術

該技術將PCR 技術與免疫酶技術進行結合，在食品致病性微生物的快速檢測過程中體現(xiàn)出了較強的技術性。PCR-ELISA 技術所得檢測結果與凝膠電泳方法所測結果相比，靈敏度更高，屬于一種新型病毒DNA 檢測技術。通過液相雜交法，使標記有生物素的PCR 擴增產(chǎn)物與特異探針呈液相混合，將探針與微孔板進行結合，酶標記抗體與雜交分子產(chǎn)生反應，在顯色反應之后可以借助酶標儀準確讀數(shù)以評估檢測結果，具有較高的檢測準確率。

2 在常見食品微生物檢測過程中的PCR 應用探討

2.1 沙門氏菌

對于許多食品而言，沙門氏菌數(shù)量相對比較少，主要原因在于食品在生產(chǎn)與加工過程中，會受到各種各樣的原因，對食品中原有沙門氏菌產(chǎn)生一定的損傷作用，導致沙門氏菌含量顯著下降，而這種現(xiàn)象很有可能導致食品微生物檢測缺乏一定的準確性價值。多重PCR 技術可以有效鑒別出沙門氏菌的血清型信息，同時還可以檢測出其中的突變狀況，一般在比較常用的特異引物基因中包含invA、invB、invC、invE、fimA、hns 以及spvd 等。在相關研究中，有學者利用沙門氏菌的特異性基因hns、invA、invB 作為引物，多重PCR 技術檢測應用過程中發(fā)現(xiàn)，二重PCR 與單一PCR 檢測之間具有一定的相似性，而三重PCR 技術可以顯著提高檢測靈敏度，與常規(guī)檢測方法相比之下，PCR 技術的檢測檢出率相對十分高[3]。

2.2 腸出血性大腸桿菌

在大腸桿菌中所產(chǎn)生的毒素普遍具有相似性，以往的單一PCR 技術難以有效鑒定出大腸桿菌以及出血性大腸桿菌之間的差異。通過多重PCR 技術的應用，在stx2、溶血素基因、賀霉素基因、緊密素基因以及脂多糖基因等目的基因中，開展食品微生物檢測工作。有研究顯示，在免疫磁分離技術以及多重PCR 技術的共同檢測過程中，可以有效檢測出牛肉中所存在的大腸桿菌，通過stx1、stx2、eae 及hly 等基因的分析，有效鑒別出大腸桿菌的主要類型[4]。在相同檢測方法應用中，對牛肉中的大腸桿菌O157:H7流行因子，體現(xiàn)出了較高的檢測效果，與以往的血清法檢測結果相比，多重PCR 檢測技術具有極高的檢測準確性與靈敏度、實用性。

2.3 金黃色葡萄球菌

這類微生物在蔬菜、生肉中十分常見，具有較高的繁殖量，在繁殖結束后會形成腸毒素SE，并且很有可能出現(xiàn)食物中毒現(xiàn)象。而在腸毒素SE 檢測過程中，通常需要針對sea、seb、sed、seh 及sei 等基因進行檢測。在相關研究中發(fā)現(xiàn)，將腸毒素基因、金黃色葡萄球菌中的23S rRNA、編碼耐熱核酸酶基因進行結合而形成的PCR 檢測方法，可以有效檢測出牛奶、生肉中所存在的金黃色葡萄球菌。免疫檢測法在檢測應用過程中很難檢測出腸毒素基因，需要應用更高靈敏度的檢測技術，PCR 技術可以有效滿足金黃色葡萄球菌的檢測需求。

2.4 產(chǎn)單核李斯特菌

個別國家、地區(qū)中所出現(xiàn)的食品中毒事件中發(fā)現(xiàn)了主要致病菌是產(chǎn)單核李斯特菌，市場部門與食品檢測部門對此十分關注，該致病菌很有可能使人類、動物產(chǎn)生相同的疾病，尤其在未經(jīng)烹煮的食品、肉類中尤為常見，而易受該致病菌感染的人群主要為幼齡兒童、老年人以及存在免疫功能缺陷等人群。這種致病菌具有較強的耐低溫性特點，可以在普通冰箱中正常繁殖，在部分防腐劑的應用中還可以體現(xiàn)出一定的抗性特點，因此很難有效清除食品中所存在的產(chǎn)單核李斯特菌。以往的致病菌檢測需要先從樣品中培養(yǎng)細菌，而PCR 技術可以直接在樣品中進行，在李斯特菌感染的肉類產(chǎn)品中，應用半套式PCR 技術，可以模擬陽性牛奶致病菌，在存活10 個以上活菌的情況下，可以擴增出對應特異性產(chǎn)物，與傳統(tǒng)PCR 技術相比，體現(xiàn)出了更為優(yōu)異的檢測靈敏度。在實際檢測試驗結果中發(fā)現(xiàn)，ERIC2PVR 技術可以通過擴增過程獲取1 600 bp 的DNA 片段，在兩種檢測方法應用中所形成的檢測結果十分相似。在PCR 擴增過程中可以發(fā)現(xiàn)李斯特菌中的inl 靶基因屬于特有基因片段，然而現(xiàn)階段并沒有在該致病菌的其他類型中發(fā)現(xiàn)相應的基因片段，而通過對沙門氏菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的檢測結果對比中發(fā)現(xiàn)，實際檢測結果均為陰性，因此在PCR 檢測產(chǎn)單核李斯特菌中具有較高的檢測價值。

2.5 非致病菌

相關研究顯示，將rRNA ISR 與16S rRNA 共同構建形成多重PCR 技術，通過對真空包裝中的牛肉進行檢測，分別應用變形梯度凝膠電泳法與PCR 技術進行檢測，在實際檢測結果中發(fā)現(xiàn)，兩種檢測方法所得出來的結論基本相似，體現(xiàn)出了在發(fā)酵時間越長的情況下，非致病菌檢出率越高[5]。在檢測過程中，多重PCR 技術具有良好的重復性優(yōu)勢，有效解決了以往在16S rRNA 無法重復檢測出泡菜中所存在的乳酸菌難題，體現(xiàn)出了優(yōu)良的檢測價值。

3 PVR 技術在食品微生物檢測中的流程分析

3.1 引物設計

一般來說，擴增特異性的情況下，PCR 引物往往具有關鍵作用，PCR 引物質(zhì)量與之具有密切的關系。引物一般待在分析基因組中的高度保守區(qū)域中，且長度一般是18 ～30 個堿基。對于多重PCR 引物而言，退火溫度要盡量保持一致，可以有效滿足引物在所選擇的退火溫度下具有相同的擴增效率，因此還要確保這些引物之間不存在各類相互作用影響。此外在引物設計過程中，還要結合分子生物學軟件開展分析工作，要注意利用電泳以及其他方法，將所擴增的產(chǎn)物大小有效區(qū)分開。

3.2 制備模板

應用PCR 檢測技術，為了能夠保障PCR 檢測可靠性，不僅依賴于檢測方法的精準性，更依賴目標模板純度以及目標分數(shù)數(shù)量大小，而在大多數(shù)情況下，PCR 檢測技術要求富集步驟。在相關研究表明，在檢測前階段將食品原樣中的細菌得以有效分離出來，并在濃縮、純化過程中有效改善檢測結果[6]。就現(xiàn)階段而言，各類分離純化方法在食品體系中的細菌濃縮過程中具有較為廣泛的應用，其中陰陽離子交換數(shù)值、免疫磁性分離法、固定化凝集素等最具有代表性。

3.3 擴增基因

擴增DNA 片段序列的不同供選擇適宜的PCR參數(shù)，在退火時間、溫度、引物中進行PCR 擴增作用，也可以應用定量PCR 技術、多重PCR 技術以及巢式PCR 等衍生技術進行基因擴增，以保障PCR 技術檢測應用效果得到進一步提升。

3.4 PCR 產(chǎn)物分析

在擴增基因之后將所擴增得到的產(chǎn)物，以凝膠電泳、染色處理時，借助紫外線照射可以清晰地看到擴增特意區(qū)段中的DNA 帶，在不同DNA 帶下可以有效鑒定出相應的DNA。為了能夠有效提高對擴增產(chǎn)物的檢測質(zhì)量，也可以借助序列測定等方法，在序列分析中提高檢測結果準確率[7]。

4 結語

在生物技術與自動化技術的快速發(fā)展過程中，PCR 技術的應用使我國食品安全檢測領域有了顯著的發(fā)展成果，應用PCR 技術不僅有利于提高微生物檢測水平，還可以推動跨國貿(mào)易質(zhì)量得到進一步發(fā)展，具有極其關鍵的意義與價值。