淺析酶抑制法在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用及酶源的研究進(jìn)展

趙素娟，包 琴，趙麗杰

（1.四川省輕工業(yè)研究設(shè)計院有限公司，四川成都 610084；2.西安市糧油質(zhì)量檢驗中心，陜西西安 710000）

1 農(nóng)藥殘留及其危害

我國一直以來都是以農(nóng)業(yè)為主導(dǎo)的國家，在全球化的推動下，大量的農(nóng)產(chǎn)品開始向海外輸出。作為一個農(nóng)業(yè)大國和出口大國，我國在食品安全和農(nóng)產(chǎn)品安全方面的問題日益突出。在農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展過程中，農(nóng)藥在維持高效的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面發(fā)揮著重要作用。因此，廣泛使用農(nóng)藥管理生產(chǎn)是高投入集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)的主要特征[1]?？茖W(xué)合理使用農(nóng)藥能達(dá)到對農(nóng)產(chǎn)品的防病、防蟲害效果，同時也能保證穩(wěn)定生產(chǎn)農(nóng)產(chǎn)品，有效增加產(chǎn)品產(chǎn)量和避免巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[2-4]；但不合理投入使用農(nóng)藥會對農(nóng)產(chǎn)品造成污染，農(nóng)藥會殘留在作物表面（莖、葉、果實和根等部位）。如今，人們的消費(fèi)能力不斷增強(qiáng)，食品安全問題也多次敲響警鐘，人們越來越關(guān)注農(nóng)藥殘留帶來的危害，如HADIAN 等[5]分析了不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的48 種農(nóng)藥殘留物包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、有機(jī)氮和擬除蟲菊酯等其他化學(xué)基團(tuán)在水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留情況；DIOPA 等[6]對達(dá)克爾地區(qū)的農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀進(jìn)行了分析檢測，多份樣品被檢出農(nóng)藥殘留，從檢出率結(jié)果可以得出，應(yīng)指導(dǎo)種植者合理使用農(nóng)藥，并嚴(yán)控農(nóng)藥的使用量。為保障人們的身體健康，也應(yīng)重視對農(nóng)藥殘留量的檢測以及其檢測技術(shù)的開發(fā)與研究。

2 農(nóng)藥殘留檢測方法

目前，市場對農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量的檢測提出了更多的要求，使用快速、有效、方便和低成本的手段得出結(jié)果的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)逐漸符合我國目前的市場要求。已知的農(nóng)藥殘留檢測方法有多種，目前使用較多的方法大致分為經(jīng)典方法與快檢方法。經(jīng)典方法能夠定性、定量分析樣品中農(nóng)藥殘留量，一般需使用大型的精密儀器才能有效檢測樣品，主要包括色譜法（氣相色譜法、液相色譜法）[7-10]、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[11]，分析范圍廣，能對樣品進(jìn)行多通道分析，也有利于樣品的多種農(nóng)藥殘留組分分析，具有儀器靈敏度高、檢測限低等特點(diǎn)。經(jīng)典法是目前使用較多也是較為成熟的檢測方法，在環(huán)境、生物、化學(xué)和藥學(xué)等領(lǐng)域都有深入的應(yīng)用。經(jīng)典儀器法對檢測人員的技術(shù)要求高，對樣品的前處理要求嚴(yán)格，儀器使用前后的設(shè)備維護(hù)成本高，且檢測樣品農(nóng)藥殘留所需時間長，其更適合監(jiān)督檢測部門使用而不適宜基層部門在市場中對快銷農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測。快檢方法可實時實地快速檢測產(chǎn)品是否合格，其配套儀器簡單、耗材成本低，對檢測人員技術(shù)要求低，在農(nóng)貿(mào)市場、農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)地、果蔬銷售門店、超市和家庭等地方都能進(jìn)行檢測，常用的快檢方法有酶聯(lián)免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[12]、生物傳感器法[13]、酶抑制法[14-15]等。

3 酶抑制法

酶抑制法在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用是在1951 年提出的，其應(yīng)用廣泛也較早。酶抑制法的主要檢測原理是有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶與羧酸酯酶等有很強(qiáng)的抑制力，能進(jìn)一步影響酯酶酶促反應(yīng)中酶與底物的反應(yīng)過程，從而影響底物與顯色劑的反應(yīng)，這種顯色反應(yīng)可在生物體外反映出農(nóng)藥的抑制力[16-17]。在整個反應(yīng)過程中，可觀察到酶促反應(yīng)體系會產(chǎn)生一定的顏色變化，或酶與某些特定化合物結(jié)合后其理化信號強(qiáng)弱會發(fā)生變化，從而判定樣品中是否含有農(nóng)藥以及農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)。一般情況下，在體外的實驗檢測中，農(nóng)藥的添加會使檢測用酶的酶活受到一定的影響，當(dāng)提高農(nóng)藥的添加量時，所用酶的酶活性會減小，酶對底物水解后生成的底物累積量與酶活性成正相關(guān)，酶活力越大，產(chǎn)物就越多。近年來，市場上使用的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)、農(nóng)藥殘留檢測設(shè)備大多是基于酶抑制法的原理設(shè)計。目前市場上已研制出多種基于酶抑制法原理的農(nóng)藥殘留快速檢測試劑盒，且國外多個國家也將這類試劑盒作為在田間進(jìn)行初步篩查農(nóng)藥殘留量的主要手段。酶抑制法具有方法簡單易于操作、成本低、檢測用時短、可行性高和樣品檢測量大等特點(diǎn)，大部分方法對樣品的要求不高，簡單處理后即可檢測，適合基層執(zhí)法人員、家庭及個人使用。酶抑制法目前是市場使用最廣泛的方法，國內(nèi)也出臺了多個標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)其使用，如GB/T 18625—2002、GB/T 18626—2002、GB/T 18630—2002 等。因此，酶抑制法是農(nóng)藥殘留快檢技術(shù)中一種非常重要的檢測方法。

4 酶抑制法快檢方法

4.1 分光光度法（比色法）

分光光度法的檢測原理為提取的樣品溶液與酶液反應(yīng)一段時間后，加入底物與顯色劑，在有機(jī)磷類農(nóng)藥或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的作用下，檢測酶液的酶活會受到抑制從而影響酶促反應(yīng)，再利用配套的儀器設(shè)備比色分析，判斷樣品溶液中的農(nóng)藥殘留含量是否超標(biāo)[18-19]。此類基于酶抑制法的快速檢測方法由于其技術(shù)要求不高，使用人員經(jīng)簡單培訓(xùn)后即可掌握，因此該方法也是我國使用最多的方法，在市場中受到基層執(zhí)法人員的歡迎。

4.2 試紙法

預(yù)先將酶與底物或與底物類似的物質(zhì)經(jīng)處理后固定在濾紙片上，檢測時將待測樣品溶液置于固定化后的紙片上，通過目測紙片上的顏色深淺再對比分析，從而判定樣品農(nóng)藥殘留含量情況。常用的底物為靛酚乙酸酯，當(dāng)酯酶與靛酚乙酸酯發(fā)生酶促反應(yīng)后，會生成藍(lán)色的靛酚與乙酸物質(zhì)，靛酚在紙片上會顯現(xiàn)出藍(lán)色，樣品農(nóng)藥殘留含量越高在紙片上顯現(xiàn)的藍(lán)色會越淺，經(jīng)過測試后的紙片一般會出現(xiàn)藍(lán)色、淺藍(lán)色、白色這幾種層次的顏色。該方法用時短、成本低，常用于果蔬農(nóng)藥殘留快檢[20]。

4.3 酶傳感器法

生物敏感器件與傳感器相結(jié)合時，可用于分析一些特定的化學(xué)物質(zhì)。生物敏感器件的主要作用是與待檢化合物發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，傳感器是將這種反應(yīng)轉(zhuǎn)換放大為一種可記錄與分析的信號。利用這一特點(diǎn)，可研制出能用于檢測農(nóng)藥殘留的酶傳感器從而應(yīng)用于快檢市場中[21]。此類基于酶抑制法的酶傳感器的響應(yīng)值大小一般是由酶與底物相互作用的效果決定的，因此該方法對酶活和底物的要求較高，底物在反應(yīng)中具有重要作用，要拓展傳感器的使用，選擇合適的底物是一個重要標(biāo)準(zhǔn)。AChE 和BChE 這兩類酶催化水解產(chǎn)生的特異性底物乙酰膽堿鹽和丁酰膽堿鹽是電位檢測的優(yōu)先選擇底物。生物傳感器的使用效果一般用酶負(fù)載量、pH 值范圍、靈敏度和重復(fù)性等因素來表示，因此在開發(fā)研制酶傳感器的過程中，確定這些參數(shù)的最優(yōu)值非常關(guān)鍵。

5 酶抑制法酶源

酶抑制法檢測有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類等農(nóng)藥的敏感性與酶、底物、顯色劑、反應(yīng)溫度、時間和pH等因素有關(guān)，酶是影響該檢測技術(shù)靈敏度、可行性、可靠性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素[22]。目前，國內(nèi)對酶抑制法酶源的研究主要是動物酶源和植物酶源。動物酶源中提取的酯酶為乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。乙酰膽堿酯酶是從動物的紅細(xì)胞或神經(jīng)組織中分離出的，目前對它的研究最具影響力的是從美洲蟑螂的大腦中提取的酯酶。丁酰膽堿酯酶的主要來源為動物血清和肝臟，其中最具代表性的是從雞血清中提取的酯酶[23]。

目前，針對我國使用的有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，以乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶作為酶抑制法的酶源最為適宜，但乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶主要來自動物體內(nèi)，且價格昂貴，不易長時間保存，遠(yuǎn)達(dá)不到我國農(nóng)藥快速檢測的需要。植物酯酶由于來源廣泛、取材方便、成本低以及制備簡單，已引起眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注。近年來，有關(guān)植物酯酶對農(nóng)藥的敏感性的研究表明，其對農(nóng)藥檢測的靈敏度不亞于動物酯酶，部分植物酯酶甚至比動物酯酶更敏感[24]。針對目前我國存在的農(nóng)藥殘留問題，迫切需要開發(fā)一種通用、行之有效的農(nóng)藥殘留量檢測技術(shù)，以促進(jìn)農(nóng)藥殘留的快速測定。因此，資源豐富、價格低廉的植物酯酶成為人們的首選[25]。