椰毒假單胞菌酵米面亞種檢測(cè)方法研究進(jìn)展

梁美丹，尹瑋璐，黃志深，蔣佳希，張明明，肖 劍

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 511400）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Psedomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans），最初發(fā)現(xiàn)于1977年的東北酵米面中毒食品中，在2003年被劃分為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（Burkholderia gladioli）的一個(gè)病原型，該菌主要存在于谷物類發(fā)酵制品（如發(fā)酵制成的玉米面等）、薯類制品、變質(zhì)的銀耳和環(huán)境中[1]。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）可產(chǎn)生毒黃素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA）兩種毒素，米酵菌酸由于不產(chǎn)生臭味及異味，被污染的食品肉眼上無法分辨，且高溫烹飪不能去除，人體攝入微量的米酵菌酸即可引起高致病性的食品中毒，最初多發(fā)生于制作面食等東北地區(qū)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，20世紀(jì)中期以來，由該菌產(chǎn)生的米酵菌酸毒素引發(fā)的食物中毒事件已在我國(guó)涉及東北三省、云南省、浙江省、廣西和廣東省等16個(gè)省[2-10]，其中廣東省首起米酵菌酸中毒案例報(bào)道于2018年[11]，至2020年共5起相關(guān)案例[12]。有研究報(bào)道，該菌產(chǎn)生的毒素引發(fā)食品中毒病死率為68%～89%[10]，其致病性強(qiáng)，死亡率高，是迄今為止在我國(guó)發(fā)病率和死亡率極高的食源性致病菌[13]。本文對(duì)椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢測(cè)技術(shù)方法進(jìn)行了綜述。

1 檢測(cè)技術(shù)

1.1 微生物法培養(yǎng)技術(shù)

目前，我國(guó)對(duì)椰毒假單胞菌酵米面亞種的檢驗(yàn)方法主要是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）檢驗(yàn)》（GB 4789.29—2020）[14]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法。該方法需要根據(jù)樣品類型進(jìn)行不同的前處理，首先將樣品進(jìn)行增菌，隨后在不同的平板中分離菌株，可疑菌落進(jìn)行初步生化及鏡檢，椰毒假單胞菌酵米面亞種的許多特點(diǎn)與洋蔥假單胞菌相似[15]，需要專業(yè)人員確認(rèn)；隨后將菌株純化培養(yǎng)、生化鑒定，陽性結(jié)果需做毒性試驗(yàn)，該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無法給食品的安全性提供及時(shí)準(zhǔn)確的判斷。

1.2 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序是基因檢測(cè)的方法之一，通過讀取序列信息可以對(duì)物種進(jìn)行分類、分型、溯源，并從基因序列中尋找具有研究?jī)r(jià)值的片段。16S rRNA基因是研究生物系統(tǒng)發(fā)育及分類的框架基礎(chǔ)，基因擴(kuò)增的產(chǎn)物測(cè)序經(jīng)比對(duì)后可確定菌株的發(fā)育關(guān)系及種屬。焦振泉等[16]對(duì)不同來源樣品的椰酵假單胞菌的16S rDNA測(cè)序，確定了椰酵假單胞菌與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌等的親緣關(guān)系。曲春楓等[17]對(duì)代表菌株的基因片段進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序分析，確定椰毒假單胞菌為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）屬分類下的一個(gè)種。王崗等[18-19]對(duì)椰毒假單胞菌酵米面亞種基于16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分型，然后構(gòu)建溯源數(shù)據(jù)庫，同時(shí)建立了椰毒假單胞菌酵米面亞種熒光標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（FAFLP）分型方法，最后通過實(shí)驗(yàn)比較確定FAFLP分型的準(zhǔn)確性高于VITEK 2 GN和16S rDNA。除此之外，黃庭軒等[20]通過recA序列分析比較了伯克霍爾德菌屬中72種不同種標(biāo)準(zhǔn)株的序列以及唐菖蒲伯克霍爾德菌種內(nèi)4個(gè)致病變種及環(huán)境分離株的recA序列分析，發(fā)現(xiàn)recA序列分析不僅能很好地鑒別伯克霍爾德菌屬內(nèi)不同的種，對(duì)唐菖蒲伯克霍爾德菌種內(nèi)變種的區(qū)分也有參考價(jià)值。彭子欣等[21]利用基因擴(kuò)增及測(cè)序技術(shù)研究唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相關(guān)基因，測(cè)定基因組序列后通過同源序列比對(duì)，在菌株Co14基因組染色體1上發(fā)現(xiàn)米酵菌酸和毒黃素生物合成相關(guān)基因簇，根據(jù)基因簇中基因的關(guān)系預(yù)測(cè)米酵菌酸和毒黃素的生物合成過程。陳榮橋等[22]則以Co14作為參比基因?qū)Ψ殖龅?4株唐菖蒲伯克霍爾德氏菌野生菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，基于多核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Poiymorphism，SNP）數(shù)據(jù)構(gòu)建進(jìn)化樹以研究案例菌株溯源關(guān)系。董銀蘋等[23]通過基因組測(cè)序技術(shù)及熱圖分析，研究唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病變種分離株中攜帶bon基因簇情況，該研究的DBJ菌株基因組成也和Co14菌株類似，米酵菌酸產(chǎn)毒基因簇在G2染色體內(nèi)，且包含了13個(gè)基因。通過基因測(cè)序及分型所得的信息為椰毒假單胞菌酵米面亞種的研究提供理論基礎(chǔ)。

1.3 普通PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymase Chain Reaction，PCR）是1985年發(fā)明的分子鑒定技術(shù)，并于1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。趙夢(mèng)馨等[24]設(shè)計(jì)研究比較3種檢測(cè)方法對(duì)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的鑒定效果，結(jié)果顯示，相比傳統(tǒng)生理生化鑒定方法，MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在鑒定中更為快速、準(zhǔn)確。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫信息，普通PCR及測(cè)序技術(shù)可實(shí)現(xiàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種的準(zhǔn)確鑒定，但基因擴(kuò)增后，需通過凝膠電泳、產(chǎn)物純化、基因測(cè)序等技術(shù)才能得到最終序列信息，時(shí)間成本消耗較大，不便于快速應(yīng)用。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)是一種將結(jié)果快速可視化的檢測(cè)手段，染料法簡(jiǎn)單方便、成本較低，而探針法靈敏度高、檢測(cè)快速，相對(duì)具有更強(qiáng)的特異性。林捷等[25]根據(jù)椰毒假單胞菌酵米面亞種16S～18S rRNA基因片段序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和一個(gè)TaqMan探針，該方法法抗干擾能力強(qiáng)，菌液的靈敏度為1×102CFU·mL-1，DNA的靈敏度為250 fg·μL-1。王曉雯等[26]基于米酵菌酸生物合成的基因bonM設(shè)計(jì)特異性引物和探針，構(gòu)建唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒假單胞菌酵米面亞種探針法實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，結(jié)果菌液檢測(cè)的靈敏度為 6.5×102CFU·mL-1，DNA 檢測(cè)的靈敏度為 4.8×10-4ng·μL-1。相比普通PCR檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)操作更簡(jiǎn)單快捷，節(jié)省時(shí)間成本，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確高通量的檢測(cè)需求。

1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是 2000年由 NOTOMI等[27]開發(fā)的一種新的快速核酸擴(kuò)增方法。馬曉燕等[28]根據(jù)公布的椰毒假單胞菌16S～23S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物構(gòu)建LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系，并將LAMP法與PCR法進(jìn)行比較，結(jié)果表明LAMP檢測(cè)方法具有較高的特異性和敏感性，椰毒假單胞菌的檢出限為5.4 CFU·mL-1，是PCR方法的1 000倍，經(jīng)椰毒假單胞菌人工污染的銀耳樣品檢出限為76 CFU·g-1。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要特異性探針即可實(shí)現(xiàn)較高特異性，設(shè)備要求較低、檢測(cè)時(shí)間短，具有高特異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)，是快速檢測(cè)應(yīng)用價(jià)值極高的技術(shù)。

1.6 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)

微 滴 式 數(shù) 字 PCR（Droplet Digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于目標(biāo)核酸分子的絕對(duì)定量技術(shù)，該技術(shù)無須依賴對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的絕對(duì)定量檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)[29]，在微量的檢測(cè)中具有較大優(yōu)勢(shì)。李會(huì)杰等[30]選取椰毒假單胞菌中具有高度種屬特異性且高度保守的16S～23S rRNA序列作為靶序列設(shè)計(jì)引物及探針，構(gòu)建微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)體系，該方法重復(fù)性好、靈敏度高，針對(duì)含不同菌液濃度的樣品，該方法的檢出限為361 CFU·mL-1，而用于比較的實(shí)時(shí)熒光PCR方法無法檢出該濃度污染的樣品。在同等條件下，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的高靈敏度可保證其應(yīng)用于檢測(cè)微量高毒力致病菌的準(zhǔn)確性，降低了食品中微量毒性物質(zhì)對(duì)消費(fèi)者的威脅。

2 結(jié)語

椰毒假單胞菌酵米面亞種及其毒素自20世紀(jì)70年代在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)至今，已有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)行日常監(jiān)督檢測(cè)，但是傳統(tǒng)的微生物方法檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作步驟煩瑣，難以滿足在食物中毒及應(yīng)急事件中快速檢測(cè)的需求。隨著生物、化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)已作為一種快速檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于致病菌、病毒的檢測(cè)中。因此，今后的研究重點(diǎn)主要針對(duì)于椰毒假單胞菌酵米面亞種快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)方法、不同食品中椰毒假單胞菌酵米面亞種的生長(zhǎng)規(guī)律、風(fēng)險(xiǎn)情況、產(chǎn)毒機(jī)制及預(yù)防措施，有效地從原料儲(chǔ)藏、生產(chǎn)加工、銷售等環(huán)節(jié)預(yù)防和降低由該菌及其毒素污染引發(fā)的食物中毒。