采用更精準(zhǔn)、非靶向鑒別手段，保證食品真實(shí)性
——探索高通量基因測序技術(shù)未來發(fā)展之路

□ 文 張聰

3月15日晚，央視“3·15晚會”曝光了一系列問題食品，其中包含5家食品企業(yè)用低價木薯粉和玉米粉混制冒稱“紅薯粉條”“山藥粉條”等造假摻偽亂象。最終，當(dāng)?shù)乇O(jiān)管部門依法查封涉事生產(chǎn)經(jīng)營場所，查扣涉事原料及產(chǎn)品，責(zé)令停止生產(chǎn)經(jīng)營活動，企業(yè)負(fù)責(zé)人全部被公安機(jī)關(guān)帶走調(diào)查，并出臺了相應(yīng)的整治工作方案。此次事件，使“食品真實(shí)性”問題再一次被推上風(fēng)口浪尖。

什么是食品真實(shí)性？

提到食品真實(shí)性，也許很多人會感到一頭霧水，近年來在國際社會上廣受關(guān)注的熱門名詞“食品真實(shí)性”到底是什么?

事實(shí)上，食品真實(shí)性和食品安全、食品質(zhì)量并列，是食品的三大屬性之一。與食品安全性相比，近年來食品真實(shí)性問題引發(fā)的事件在國內(nèi)外也造成了一定的轟動：2013年愛爾蘭食品安全局揭露的非法“馬肉摻假”丑聞，幾乎牽涉到歐洲所有的國家；再如，受利益驅(qū)動，香米中摻雜更便宜的品種、將豬肉上色當(dāng)作牛肉售賣、選購煙臺蘋果但其實(shí)際產(chǎn)地并非煙臺、蜂蜜中添加果葡糖漿……食品造假事件在人們的生活中屢見不鮮，生產(chǎn)以次充好的產(chǎn)品，標(biāo)示虛假的產(chǎn)地、生產(chǎn)廠名、廠址等，均屬于食品真實(shí)性問題。

食品真實(shí)性鑒定技術(shù)發(fā)展的時代背景

隨著食品造假技術(shù)的演變，采用常規(guī)手段越來越難以檢測食品的真實(shí)性，導(dǎo)致其成為全球共治的監(jiān)管難題，亟須更有針對性的精準(zhǔn)鑒別手段。自2013年歐盟爆發(fā)“馬肉風(fēng)波”以來，歐盟將食品真實(shí)性技術(shù)研究列入Horizon2020項(xiàng)目重點(diǎn)研究領(lǐng)域；2014年，食品科學(xué)界將食品真實(shí)性單獨(dú)列出，與食品安全和食品質(zhì)量并駕齊驅(qū)，成為消費(fèi)者關(guān)注的熱點(diǎn)。在我國，政府也高度重視真實(shí)性鑒定問題—2017年，科技部正式發(fā)布《“十三五”食品科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》，首次明確提出了“食品反摻假控制技術(shù)”專項(xiàng)研究項(xiàng)目，支持食品真實(shí)性技術(shù)的發(fā)展。

龐大的檢測需求極大地催生了食品真實(shí)性鑒定技術(shù)的發(fā)展，一些對于鑒定結(jié)果要求較高的機(jī)構(gòu)也開始運(yùn)用高通量基因測序技術(shù)在該領(lǐng)域進(jìn)行試水。那么，與其他鑒定方法相比，高通量基因測序技術(shù)有著怎樣的優(yōu)缺點(diǎn)？國內(nèi)使用這一技術(shù)進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定的水平如何？發(fā)展前景又是怎樣的呢？帶著這些問題，《食品安全導(dǎo)刊》雜志特設(shè)“高通量基因測序技術(shù)用于食品真實(shí)性鑒定”專題，邀請中國農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究室主任陳愛亮、廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所微生物室副主任甘永琦、國家蛋白質(zhì)科學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施（北京）北大分中心蛋白質(zhì)核心支撐平臺技術(shù)主管李桂瀾、SGS中國區(qū)健康食品行業(yè)負(fù)責(zé)人楊潞芳博士這4位專家，以及華大智造中國區(qū)市場部總監(jiān)雷瑩共同探討食品真實(shí)性鑒定的相關(guān)問題及高通量基因測序技術(shù)的發(fā)展。

食品真實(shí)性現(xiàn)狀及不同的檢測技術(shù)

我國當(dāng)前的食品質(zhì)量安全狀況逐步好轉(zhuǎn)，但總體形勢依然嚴(yán)峻，食品造假摻偽等情況時有發(fā)生。陳愛亮表示，食品摻假是基于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動的用低值食品成分冒充高值食品成分的行為，因此一般相對價值較高的食物更容易被摻假，如用鴨肉冒充羊肉。實(shí)際上，食品摻假現(xiàn)已廣泛發(fā)生在各種動植物食品中，除了上述的鴨肉冒充羊肉，還有豬血冒充鴨血、牛奶冒充羊奶、普通奶冒充A2奶、油魚冒充鱈魚、意蜂蜜冒充土蜂蜜、玉米油冒充橄欖油等等，這些屬于物種成分摻假；此外，還有產(chǎn)地來源造假，如假冒拉菲紅酒、鹽池灘羊肉等。這里要說明的是，食品摻假不僅僅在中國，在國外也是廣受關(guān)注的食品安全問題。由于食品摻假的查處難度大，監(jiān)管成本高，故已成為全球性的挑戰(zhàn)。

那么，一般會選擇采用怎樣的檢驗(yàn)方法對摻假食品進(jìn)行辨別？陳愛亮老師也給出了答案?！搬槍Σ煌膿郊傩问?，需要用到不同的檢驗(yàn)方法。目前來說，用于食品摻假的鑒定方法主要有4類，一是色/質(zhì)譜、核磁方法，主要通過分析食物代謝物的組成成分進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定；二是DNA分析法，即通過測定食物DNA對食品物種來源進(jìn)行鑒定；三是元素分析法，通過測定食品中穩(wěn)定同位素及礦物元素比值，對食品的產(chǎn)地來源進(jìn)行鑒定；除此以外還有紅外光譜等技術(shù)?！标悙哿晾^續(xù)說道，“其中，DNA分析法中又包括熒光定量PCR法、DNA條形碼和高通量測序方法等，且DNA條形碼和高通量測序會用到基因測序儀。實(shí)際上，DNA分析法是目前公認(rèn)的食品摻假物種鑒定最穩(wěn)定和可靠的方法之一?！?/p>

在食品真實(shí)性鑒別方面，高通量測序技術(shù)雖然已經(jīng)得到了部分應(yīng)用，但由于該技術(shù)數(shù)據(jù)量大，結(jié)果分析要求高，缺乏相關(guān)的高通量測序分析方法標(biāo)準(zhǔn)，因此在國際上并未大規(guī)模普及。據(jù)了解，與國際相比，國內(nèi)高通量測序技術(shù)在食品真實(shí)性鑒定方面的應(yīng)用報道較少，且大多處于研究起步階段，尚未在企業(yè)質(zhì)檢中心等廣泛推廣普及。從檢索相關(guān)文獻(xiàn)資料的情況來看，近年來，我國相關(guān)數(shù)據(jù)庫中“高通量基因測序技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用”名錄下已有千余篇文獻(xiàn)研究，表明該領(lǐng)域的研究已有一定基礎(chǔ)，還有較大的發(fā)展空間。

高通量基因測序技術(shù)的優(yōu)勢所在

高通量基因測序技術(shù)是一次能對幾十萬到幾百萬條核酸分子進(jìn)行序列測定的技術(shù)，其經(jīng)過將待測的目標(biāo)DNA片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中DNA片段進(jìn)行大規(guī)模平行測序，檢測對應(yīng)的信號，最終獲取序列信息。因此，即使食品摻假的手段再“高明”，也難逃它的“法眼”。

例如，蜂產(chǎn)品摻假包括完全用糖漿和香精勾兌的人造蜂蜜、在天然蜂蜜中加入果葡糖漿等各種糖漿等的混摻蜂蜜，以及直接喂食蜜蜂糖水的劣質(zhì)蜂蜜；除此之外，還有蜜源造假，即用雜花蜜冒充單一花品種蜜，用意蜂蜜冒充中蜂蜜等。“對于蜜源造假，一般可以通過檢測蜜源植物或蜜蜂物種特異性的DNA進(jìn)行鑒定。由于蜂蜜中的植物來源可能存在多種且未知的情況，利用高通量測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)樣品中各種物種源性成分的快速鑒定，與傳統(tǒng)的PCR鑒定方法相比，具有非靶向、高通量及定量分析的優(yōu)勢。”陳愛亮解釋說：“其實(shí)高通量測序技術(shù)最大的優(yōu)勢之一就是對于混合生物制品中的所有物種成分進(jìn)行全景掃描，同時給出各物種成分的含量，因此對于食品企業(yè)復(fù)雜食品原料質(zhì)控具有重要的意義。比如出口阿拉伯食品企業(yè)、中成藥企業(yè)等對復(fù)雜原料物種成分的鑒定，利用高通量測序技術(shù)可以提高鑒定的準(zhǔn)確率和效率。”

再如，肉類加工食品在生產(chǎn)過程中原料需經(jīng)絞碎等處理，配以輔料與添加劑，通過熏、煮或炸等特殊工序而具有良好的外觀和風(fēng)味。由于消費(fèi)者難以通過感官分辨產(chǎn)品中的肉類與配料表是否一致，所以部分商家為了降低成本，會在產(chǎn)品中有目的地替代或添加價格低廉的肉類。對此，甘永琦說道：“由于常規(guī)檢測方法每次只能確定或排除一種已知的動物源成分，無法適用混合肉制品的組成比例分析及未知摻假肉類的鑒定，與摻假手段的隱蔽性和復(fù)雜性相比具有嚴(yán)重的滯后性，難以滿足對肉制品摻假造假檢測的需要。因此，在食品真實(shí)性鑒定方面，肉類加工食品也會較多地應(yīng)用到高通量測序技術(shù)。”對此，甘永琦也提出了他的解決方法—將DNA條形碼和高通量測序技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)新研發(fā)出DNA宏條形碼技術(shù)，其在分析食品中動物源性成分具有多方面優(yōu)勢：一是對生物混合體系具有強(qiáng)大的分析能力，可同時檢測標(biāo)識成分、混偽品、有毒動物或受保護(hù)動物的成分，以及在生產(chǎn)過程中引入的其他動物雜質(zhì)，從而保證肉制品的有效性、安全性與合法性；二是對于物種的鑒別具有唯一性，可以從基因角度對不同物種進(jìn)行分析并能準(zhǔn)確將其界定；三是可進(jìn)行生物混合體系中各物種成分的相對定量分析，通過測序?qū)⑺形锓N的序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），利用生物信息軟件與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

政策支持和市場機(jī)遇為發(fā)展賦能

利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定是該技術(shù)近年來發(fā)展的新領(lǐng)域，在國內(nèi)，SGS于2017年底便開始為企業(yè)提供動物性食品、植物性食品及魚類產(chǎn)品的二代測序服務(wù)。歐美等國也已通過高通量測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對肉品DNA混合物的物種成分分析、蜂蜜的真?zhèn)舞b別等。此外，高通量測序技術(shù)在深加工食品的鑒定中也得到了很好的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對糖果中物種成分的鑒別。目前，這一技術(shù)的研究重點(diǎn)為圍繞數(shù)據(jù)庫比對、閾值設(shè)定、生物信息學(xué)分析等方面提高物種鑒定的效率和準(zhǔn)確性。

國際標(biāo)準(zhǔn)化工作方面，2021年10月，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布ISO 22949-1-2021，規(guī)定了食品和飼料產(chǎn)品中動物物種檢測和鑒定中DNA測序方法性能的一般要求。楊潞芳介紹道，“經(jīng)專家多年研討，ISO 22949-1-2021形成了測序方法的整體框架和通用要求，包括引物設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、方法評價、實(shí)驗(yàn)室測試等各個環(huán)節(jié)，從樣品制備到核酸提取，再到一代/二代測序的流程，直至測序結(jié)果表述，總體來說是一項(xiàng)流程完整的通用測序規(guī)定。雖然高通量基因測序技術(shù)已經(jīng)在生物、醫(yī)學(xué)、大健康等領(lǐng)域有了較為成熟的應(yīng)用，但在食品領(lǐng)域的發(fā)展尚屬起步階段?？梢灶A(yù)見的是，作為食品與飼料領(lǐng)域有關(guān)DNA測序方法的首個ISO標(biāo)準(zhǔn)，這一標(biāo)準(zhǔn)的出臺將為該技術(shù)在食品和飼料領(lǐng)域特別是食品真實(shí)性鑒定方面的廣泛應(yīng)用鋪平道路?！?/p>

在我國，國家層面出臺的各項(xiàng)相關(guān)政策也正在持續(xù)發(fā)力。楊潞芳表示，《“十四五”市場監(jiān)管科技發(fā)展規(guī)劃》中提出，在食品真實(shí)性鑒別及溯源技術(shù)研究方面，要研究食品中未知摻假物的非靶向篩查、精準(zhǔn)定量、產(chǎn)地溯源、身份標(biāo)識及品質(zhì)識別技術(shù)，建立完善經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動摻假（EMA）數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建全鏈條智能追溯系統(tǒng)，來解決食品真實(shí)性原料質(zhì)量管控和溯源瓶頸問題。她說道：“在特殊食品及新技術(shù)食品安全監(jiān)管關(guān)鍵技術(shù)研究中，同樣也提到要對未知與非食用物質(zhì)風(fēng)險高通量篩選和評價，這無疑是享有高通量、非靶向及定量分析優(yōu)勢的高通量基因測序技術(shù)發(fā)展的一個契機(jī)。要想實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，需要多學(xué)科領(lǐng)域人才的協(xié)同創(chuàng)新，如食品學(xué)科、化學(xué)學(xué)科、分子生物學(xué)科、生物信息學(xué)科等，進(jìn)而整合各方資源實(shí)現(xiàn)行業(yè)長足發(fā)展。而該目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)對于某個企業(yè)或機(jī)構(gòu)來說難度不言而喻，所以將其作為國家政策對該技術(shù)進(jìn)行指引和號召，將更強(qiáng)有力地推動我國高通量基因測序技術(shù)在食品真實(shí)性鑒別方面的發(fā)展?！?/p>

事實(shí)上，在使用高通量測序技術(shù)進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定時，幾位專家也在實(shí)際操作中遇到了一些痛點(diǎn)問題。

第一，無具體的國標(biāo)方法可以參考。據(jù)李桂瀾介紹，在使用該技術(shù)進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定方面，因國家并未出臺具體的國標(biāo)方法，國內(nèi)外研究學(xué)者們通過在實(shí)際操作中不斷的探索，最終形成了幾種較為一致的檢測準(zhǔn)確度的鑒定方法，如使用16s和12s核糖體RNA的高通量測序分析以及DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行肉類的摻假檢測。

第二，對測序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)分析能力要求高。高通量測序技術(shù)具有高通量、非靶向和定量分析的優(yōu)勢，可以對食物樣品中的所有潛在物種源性成分一次性全部鑒定出來，并給出相對含量。但也正是由于高通量測序能夠生成大量的基因測序數(shù)據(jù)，因此對測序大數(shù)據(jù)的分析技術(shù)要求非常高，除了高通量測序數(shù)據(jù)的常規(guī)分析外，對于物種鑒定，還涉及比對數(shù)據(jù)庫的權(quán)威性、物種認(rèn)定的同源性閾值設(shè)定、測序reads數(shù)的百分比閾值設(shè)定等多個方面，需要根據(jù)不同的食物類型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究來最終確定。

第三，高通量測序儀器及配套耗材價格昂貴。與其他鑒定技術(shù)相比，高通量測序試劑總體來說成本較為昂貴，因此從儀器、試劑盒等配套乃至整個供應(yīng)鏈的國產(chǎn)化比率提高都顯得尤為重要。

針對上述挑戰(zhàn)，亟需從以下幾個方面著手進(jìn)行解決。首先，應(yīng)該篩選穩(wěn)定可靠的各種食物物種核心DNA條形碼及輔助條形碼序列，建立權(quán)威可靠的物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫；其次，針對不同類型食物物種成分，開展模擬摻假鑒定研究，開發(fā)物種鑒定分析軟件，制定合理的同源性比對閾值以及摻假定量分析閾值，提高物種鑒定的準(zhǔn)確率；最后則是圍繞食品真實(shí)性鑒定制定相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)，包括DNA條形碼數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)、高通量基因測序方法標(biāo)準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)處理等規(guī)范等。同時，還應(yīng)加速基因測序硬件國產(chǎn)化。測序儀在整個產(chǎn)業(yè)鏈中擁有極高的技術(shù)壁壘和應(yīng)用價值，為中下游測序服務(wù)提供技術(shù)和工具的支撐，測序儀的國產(chǎn)化可以打破競爭壁壘，快速促進(jìn)行業(yè)的發(fā)展。

國產(chǎn)儀器品牌華大智造的崛起之路

高通量測序儀是基因測序“皇冠上的明珠”，從測序技術(shù)研發(fā)、驗(yàn)證到測序儀器的生產(chǎn)制造是一個系統(tǒng)工程，因此測序儀器的性能受到多種因素影響。談及儀器品牌選擇的問題，幾位專家均較為看好國產(chǎn)品牌的發(fā)展。李桂瀾認(rèn)為，就整體情況而言，國產(chǎn)儀器品牌基本上可以滿足其日常的測序需求，并已在實(shí)踐中得到驗(yàn)證，希望國產(chǎn)品牌商可以朝著提升用戶服務(wù)與體驗(yàn)的方向發(fā)展。陳愛亮提出，原本市場上的高通量基因測序儀是以進(jìn)口品牌為主，但近幾年以華大智造為代表的國產(chǎn)品牌也逐漸發(fā)展成熟起來且性能越來越穩(wěn)定好用，還具有價格優(yōu)勢，所以比較看好國產(chǎn)測序儀的發(fā)展。甘永琦表示，如果國產(chǎn)儀器的性能可以與進(jìn)口比肩，則更傾向于國產(chǎn)儀器，原因是國產(chǎn)儀器性價比高，實(shí)驗(yàn)成本更低。

據(jù)悉，在國產(chǎn)測序儀器品牌中，華大智造已基本實(shí)現(xiàn)對進(jìn)口產(chǎn)品的同步與超越。華大智造總部位于中國深圳，業(yè)務(wù)布局遍布六大洲80多個國家和地區(qū)，已在全球多個國家和地區(qū)設(shè)立科研、生產(chǎn)基地及培訓(xùn)與售后服務(wù)中心，累計(jì)服務(wù)超過 1 300家用戶，是全球少數(shù)幾家具有自主研發(fā)并量產(chǎn)臨床級高通量基因測序儀能力的企業(yè)之一。

為了深入了解國產(chǎn)儀器的發(fā)展情況，本刊也邀請到華大智造中國區(qū)市場部總監(jiān)雷瑩參與本話題，她表示，就技術(shù)本身而言，有別于其他技術(shù)路線的PCR指數(shù)擴(kuò)增，華大智造獨(dú)有的DNBSEQ測序技術(shù)采用RCA滾環(huán)擴(kuò)增，每次擴(kuò)增錯誤不會累積，具有更高的準(zhǔn)確性和更低的標(biāo)簽跳躍率。同時，規(guī)則陣列芯片技術(shù)能夠提供更高的信號密度，更低的重復(fù)序列率，大幅提高檢測的準(zhǔn)確性。另一方面，華大智造已經(jīng)具備量產(chǎn)臨床級高通量基因測序儀的能力，這為充分發(fā)揮DNBSEQ測序技術(shù)的優(yōu)勢提供了保障。

如今，華大智造推出不同數(shù)據(jù)通量、測序讀長的測序儀器 型號，包 括DNBSEQ-E、MGISEQ-200、MGISEQ-2000、DNBSEQ-T7及DNBSEQ-Tx系列高通量測序儀，覆蓋SE50-SE400、PE100-PE300等 多 種讀長模式，可以實(shí)現(xiàn)從微生物基因組到動植物基因組的全場景測序應(yīng)用，這為高通量測序技術(shù)在食品真實(shí)性應(yīng)用方向的全鏈條國產(chǎn)化奠定了良好基礎(chǔ)。特別是SE400讀長的測序模式，非常適合高通量宏條形碼測序，已成功支持了多項(xiàng)宏條形碼測序的研究?！巴瑫r，為了降低設(shè)備使用門檻及提升易用性，華大智造還配套研發(fā)了自動化樣本制備系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析工具，實(shí)現(xiàn)樣本處理、基因測序、數(shù)據(jù)分析的全流程便捷高效。后續(xù)，面對目前實(shí)際操作中遇到的痛點(diǎn)問題，華大智造希望與行業(yè)各方一道，共同建立可靠的物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫、開發(fā)配套的物種鑒定分析工具、推進(jìn)相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)及技術(shù)規(guī)范的制定。最后，我們企業(yè)自身還將繼續(xù)突破與超越，持續(xù)推出性能更優(yōu)、操作更便捷、滿足不同應(yīng)用場景的國產(chǎn)測序儀器?！崩赚撊缡钦f道。

未來發(fā)展前景展望

通過與幾位專家進(jìn)行的深入交流采訪，可以看出高通量測序技術(shù)在進(jìn)行食品真實(shí)性鑒定領(lǐng)域已占有一席之地。高通量測序技術(shù)憑借其高通量、非靶向以及定量分析等其他技術(shù)無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，在食品真實(shí)性鑒別領(lǐng)域正在得到越來越廣泛的應(yīng)用。

隨著食品真實(shí)性鑒定的需求越來越多，高通量測序技術(shù)操作進(jìn)一步簡化，生物信息學(xué)分析進(jìn)一步自動化等，作為食品真?zhèn)舞b別的終極武器，相信在未來基于高通量測序的檢測方法將在食品真實(shí)性鑒定領(lǐng)域具有更大的發(fā)展空間，或?qū)⒊蔀槭称氛鎮(zhèn)舞b別中不可或缺的重要技術(shù)之一，為食品安全監(jiān)管及執(zhí)法機(jī)構(gòu)提供有效的技術(shù)支撐。