牛傳染性鼻氣管炎診斷方法概述

孫興忠，董 航，王 楠，邵洪澤，宮鵬濤，苑淑賢，姚新華，曹利利*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春 130062；2. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062

牛傳染性鼻氣管炎（IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）感染所導(dǎo)致的呼吸道疾病，發(fā)病癥狀以鼻炎、竇炎、身體高熱、呼吸困難、流鼻涕等炎性癥狀，IBRV又被人們稱為牛皰疹病毒1型（BHV-1）。在一般情況下，病毒進(jìn)入牛體后，經(jīng)常潛伏在三叉神經(jīng)以及腰薦部神經(jīng)，可造成牛只潛伏性且持續(xù)感染，嚴(yán)重病例可使終身帶毒。不同大小的牛只都可感染該病，可通過呼吸道或者生殖途徑傳播病毒，與此同時(shí)，當(dāng)隱性感染后的牛免疫力低下或受到異常刺激后，體內(nèi)的病毒被激活而排出病毒，從而感染其它牛只，所以想根治該病較為困難。

最近幾年，我國IBR的發(fā)病率在逐年增加，而該病對大型養(yǎng)殖場的影響較大，對養(yǎng)牛業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失，影響?zhàn)B牛業(yè)的發(fā)展。而IBRV的感染大多隱性時(shí)間較長，所以對于該病防控較為困難，現(xiàn)階段探索快速有效的診斷方法，對該病的防控至關(guān)重要。本文論述IBRV國內(nèi)外常用的診斷方法，為今后檢測和防控提供一定依據(jù)。

1 病原學(xué)診斷

1.1 病毒分離鑒定

通常情況下，根據(jù)病?；疾『蟊憩F(xiàn)出的不同癥狀而采集不同部位的樣品，如呼吸道型要采眼分泌物以及鼻液；生殖道類采集陰道的分泌物和外陰部的黏膜；腦膜炎采腦組織；流產(chǎn)型采胎兒心、肝、肺、腎等實(shí)質(zhì)性器官等。IBRV的培養(yǎng)一般常用牛腎細(xì)胞（MDBK）來培養(yǎng)效果最佳，細(xì)胞感染后發(fā)生病變在4 d左右，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓和似葡萄形狀聚集并出現(xiàn)空洞等形態(tài)即為病變細(xì)胞[1]。形態(tài)上觀察為初步確診為IBRV，想深一層確診是否感染IBRV需進(jìn)行中和試驗(yàn)、間接免疫熒光試驗(yàn)以及單抗試驗(yàn)[2]。王延濤[3]從患病牛場的牛陰道分泌物中得到病毒，并將該IBRV用于進(jìn)出口檢疫中對病毒的快速檢測。李琳琳[4]等運(yùn)用MDBK從患病進(jìn)口奶牛鼻炎中獲得IBRV，獲得的病毒在MDBK上培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）,并用PCR驗(yàn)證出現(xiàn)明顯目的條帶。該方法鑒定準(zhǔn)確，但需耗費(fèi)時(shí)間，臨床上使用較少。

1.2 病毒核酸檢測

1.2.1 常規(guī)PCR檢測方法

現(xiàn)階段，PCR方法用于IBRV病毒檢測比較普遍，主要因其具有快速、高特異性和高敏感性等特點(diǎn)，能夠檢測牛血清、鼻拭子、呼吸道組織等樣品中微量IBRV存在。徐娜等[5]利用IBRV的gE和gB核酸序列，設(shè)計(jì)引物，最終建立PCR方法；林海等[6]利用IBRV TK設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR方法鑒別野毒株以及TK基因缺失株；王嵩等[7]利用保守序列g(shù)B設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化條件，建立快速PCR檢測方法。該方法優(yōu)于病毒分離法和血清學(xué)方法，但也會(huì)有假陽性、假陰性結(jié)果干擾，具有一定缺陷。

1.2.2 熒光定量PCR檢測方法

熒光定量PCR方法，是近幾年發(fā)展起來的方法，該方法要比常規(guī)PCR方法擁有更加高的敏感性、特異性，可以通過結(jié)果直接確定感染牛只是否感染IBRV病毒，所以該方法已廣泛運(yùn)用于實(shí)際檢測。唐泰山等[8]利用gE和gB基因序列，設(shè)計(jì)2對引物和探針，并把病毒10倍稀釋后檢測同時(shí)對三種病毒特異性檢測，結(jié)果靈敏度達(dá)到0.02 T CID50,且特異性好無交叉反應(yīng)。喬波等[9]gB基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR方法，可對疑似病例快速檢測。謝志勤等[10]分別運(yùn)用IBRV gB基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針、BVDV基因設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立臨床鑒別的雙重?zé)晒釶CR方法。

2 血清學(xué)檢測

2.1 中和試驗(yàn)（VN）

中和試驗(yàn)是IBR檢測最經(jīng)典和標(biāo)準(zhǔn)的方法，同時(shí)是OIE要求對該病檢測的方法。該方法原理是用已有的BVDV病毒檢測待檢血清的中和抗體，而后檢測病毒的感染力以及免疫血清中和后的感染力。該方法優(yōu)點(diǎn)特異性、敏感性較高，但操作時(shí)間長、繁瑣而且極易受各種因素影響，因此目前用該方法比較少，將被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)所取代。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)

ELISA原理是將酶與抗原（抗體）結(jié)合形成酶標(biāo)物，特異性吸附在固相載體上，而酶標(biāo)記的抗原（抗體）仍保存酶活性和免疫活性。該種檢測方法具有快速、操作簡單、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以用來檢測牛血清、血漿、奶樣中是否有病毒感染，并且能夠區(qū)分免疫和自然感染病毒。朱遠(yuǎn)茂等[11]建立間接ELISA方法檢測牛血清抗體，具有較好特異性和重復(fù)性，與國外試劑盒符合率達(dá)96.3%。李兆利等[12]運(yùn)用gB蛋白基因建立間接ELISA方法，該方法具有簡便、易推廣、檢測樣本量大等諸多優(yōu)點(diǎn)，較多應(yīng)用于流調(diào)和臨床診斷中。馬輝等[13]通過原核表達(dá)gC蛋白，建立雙抗夾心ELISA方法和單克隆抗體，有較好特異性和敏感性，作為IBR的一種快速診斷方法。周躍輝[14]通過原核表達(dá)gD蛋白，建立雙抗夾心ELISA方法和單克隆抗體，有較好特異性和敏感性,可作為流調(diào)和診斷IBR的方法。

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是運(yùn)用病毒抗原檢測血清中抗體，也可用IBR陽性血清檢測培養(yǎng)細(xì)胞或采集的病料，Suresh S在1993年，成功運(yùn)用對流免疫擴(kuò)散和免疫擴(kuò)散方法檢測IBRV。該方法操作比較簡單，但實(shí)際檢測中敏感性較低，檢出率低。

2.4 間接血凝試驗(yàn)（IHA）

IHA是一種簡單的檢測血清中抗體方法，一般分微量凝集和試管凝集兩種方法，結(jié)果判定以紅細(xì)胞凝集程度表示陽性反應(yīng)強(qiáng)弱。陳天祥等[15]分別創(chuàng)建IHA方法，臨床運(yùn)用較好。該方法簡單、快捷，但特異性差易出現(xiàn)假陽性。

3 結(jié)語

近年來，我國規(guī)?；B(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展，牛只的跨省轉(zhuǎn)運(yùn)以及國外引進(jìn)良種等原因，致使IBR的發(fā)生也在逐年呈上升趨勢，因該病現(xiàn)階段沒有特效藥物治療，這給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)階段，IBR擁有多種診斷該病的方法，但每一種診斷方法都有各自的特點(diǎn)以及缺點(diǎn)，在使用過程中要汲取各自的優(yōu)缺點(diǎn)選擇合適的方法進(jìn)行診斷。國內(nèi)已研究并上市IBR疫苗，這也為今后IBR疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)這也對IBR病診斷技術(shù)體現(xiàn)出更高的要求和重要性。隨著新儀器和新技術(shù)的不斷發(fā)展，IBR的診斷技術(shù)不斷向著高效、敏感、簡便、快速、特異等目標(biāo)發(fā)展，配合現(xiàn)有疫苗使用，在控制或根除IBR上起到重要作用，使養(yǎng)牛業(yè)不斷進(jìn)步發(fā)展。