SFRP5基因干擾載體的構(gòu)建及鑒定

鄭 強(qiáng)

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319

隨著生活結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及飲食質(zhì)量的提高，高能食物已成為人類普遍的食物來(lái)源。雖然脂肪組織可作為機(jī)體重要的能量來(lái)源，但脂肪攝入的過(guò)多會(huì)間接導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病，如重度肥胖、高血壓、脂肪肝、高血脂等疾病，對(duì)人類健康造成了巨大的危害。從細(xì)胞層面分析，脂肪的積累既包括脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多，又包括脂滴體積的增大。從動(dòng)物個(gè)體水平分析，多個(gè)脂肪細(xì)胞的增殖和分化必然導(dǎo)致機(jī)體肥胖和疾病發(fā)生。脂肪組織可分為棕色脂肪組織（BAT)和白色脂肪組織（WAT)。棕色脂肪細(xì)胞中分布著許多脂肪滴，其細(xì)胞核分布于細(xì)胞的中央，含有許多微細(xì)的血管，棕色脂肪組織在成年動(dòng)物中很少發(fā)現(xiàn)，僅在特殊情況下出現(xiàn)。然而，幼齡動(dòng)物和冬眠動(dòng)物中含量較多，主要存在于哺乳動(dòng)物的肩胛區(qū)、頸后背部和腺體的腋窩下部。此外，有研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織自身也可以分泌脂肪細(xì)胞因子，參與調(diào)控動(dòng)物機(jī)體能量代謝和能量平衡。分泌型卷曲相關(guān)蛋白5是一種調(diào)控脂肪的重要細(xì)胞因子，其在機(jī)體能量代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，揭示脂肪細(xì)胞增殖分化時(shí)是否受到SFRP5的調(diào)控展開(kāi)具體研究，對(duì)機(jī)體肥胖的預(yù)防及與肥胖相關(guān)疾病的治療奠定基礎(chǔ)[1]。脂肪組織不僅完成了機(jī)體大部分能量的存儲(chǔ)，還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理機(jī)能。脂肪組織沉積主要通過(guò)脂肪細(xì)胞數(shù)量增多及脂滴積累兩種形式實(shí)現(xiàn)。脂肪細(xì)胞增殖與分化受諸多因素影響，Wnt信號(hào)通路是較早發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)信號(hào)通路，參與脂肪細(xì)胞增殖分化的調(diào)控。SFRP5具有雙向調(diào)節(jié)作用，可抑制Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩者共同作用，共同影響著脂肪細(xì)胞的增殖分化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載體

從VectorBuilder公司購(gòu)買SFRP5重組腺病毒干擾載體，載體名稱pAV-shRNA-EGFP（VB161026-1127kyf），pAV-mSFRP5shRNA-EGFP（VB171121-1371tah）。

1.1.2 細(xì)胞系

本實(shí)驗(yàn)室保存的HEK293A細(xì)胞、3T3-L1細(xì)胞均購(gòu)買于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基、酒精、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、質(zhì)粒提取試劑盒。

1.1.4 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、冰箱、酶標(biāo)儀、液氮罐、水浴鍋、離心機(jī)、凝膠成像儀、磁力攪拌器、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿（10 mm、60 mm）、多孔培養(yǎng)板（12、48、96孔）、吸管、移液管、移液槍、移液槍頭、顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 SFRP5腺病毒干擾載體的鑒定

將購(gòu)買的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRN A-EGFP載體在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單克隆，擴(kuò)繁后，用質(zhì)粒提取試劑盒將其中的質(zhì)粒提取出來(lái)。然后通過(guò)PacI進(jìn)行酶切，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 病毒制備

將無(wú)血清雙抗的培養(yǎng)液（Opti-MEMI）稀釋4 μg質(zhì)粒，稀釋至250 μL。將Opti-MEMI稀釋10 μL Lipofectamine TM2000稀釋25倍，在室溫下培養(yǎng)25 min。將 Lipofectamine TM2000和質(zhì)粒混合，獲得混合液，室溫培養(yǎng)20 min。將混合液放入CO2培養(yǎng)箱6 h，6孔板需要設(shè)置對(duì)照組。24 h的轉(zhuǎn)染后，用熒光顯微鏡下觀察綠色熒光和細(xì)胞的病變情況。10 d后將細(xì)胞收集，在液氮罐和恒溫水浴鍋中反復(fù)凍融5次，離心，分離上清液，用于細(xì)胞感染。

1.2.3 病毒擴(kuò)繁

將HEK293A細(xì)胞培養(yǎng)到培養(yǎng)皿面積90%時(shí)，腺病毒感染8個(gè)培養(yǎng)皿。24 h后，顯微鏡觀察到少許細(xì)胞漂浮。再經(jīng)過(guò)24 h，絕大多數(shù)細(xì)胞漂浮，收取細(xì)胞。離心10 min轉(zhuǎn)速1 200 rpm，棄掉上清液。加入培養(yǎng)液DMEM大約4 mL，反復(fù)凍融，三次即可，每次10 min。然后離心5 min轉(zhuǎn)速2 000 rpm，將離心得到的病毒保存于-80 ℃冰箱中。將293A細(xì)胞分裝到20個(gè)150 mm的培養(yǎng)皿中，用病毒感染，以獲取更多的293A細(xì)胞。48 h,病毒成熟后，PBS清洗，收集細(xì)胞，離心10 min轉(zhuǎn)速1 000 rpm，棄掉上清液，PBS沖洗1～2次，裂解病毒。超低溫冰箱（-8 ℃）保存。

1.2.4 病毒滴度測(cè)定

根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備8個(gè)無(wú)菌離心管，加入90 μL無(wú)菌培養(yǎng)基，取待測(cè)的病毒原液10 μL加入第一個(gè)管中，混勻后取10 μL加入第二管中，繼續(xù)相同操作，直至最后一管。選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基，丟棄。加入90 μL稀釋好的病毒溶液，培養(yǎng)。24 h后，加入完全培養(yǎng)基100 μL。48 h后，計(jì)算滴度。

1.2.5 重組腺病毒感染效率測(cè)定

3T3-L1細(xì)胞被腺病毒感染后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，這是被病毒所感染的細(xì)胞。將熒光顯微鏡和普通顯微鏡的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，求其感染效率。

1.2.6 HEK293A細(xì)胞培養(yǎng)

在培養(yǎng)時(shí)，取出存儲(chǔ)的細(xì)胞，放入恒溫水浴鍋（37 ℃）中，經(jīng)過(guò)1 min，在里面的冰尚未完全融化時(shí)取出。取出后，酒精擦拭消毒，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。12 h后，取出細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況。待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積的80%左右時(shí)，進(jìn)行消化。棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗，加入胰酶吹浮細(xì)胞。消化傳代后，儲(chǔ)存?zhèn)溆肹2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ad-SFRP5 shRNA腺病毒干擾載體的鑒定

從Vector Builder購(gòu)買的pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP載體，腺病毒重組載體中包含綠色熒光蛋白EGFP，SFRP5的干擾序列位于其CDS區(qū)的1078～1098 bp，插入載體的788～835 bp位置，干擾分值為13.2。對(duì)其進(jìn)行PacI單酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，Pac1酶切結(jié)果顯示pAV-shRNA-EGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP載體質(zhì)粒均釋放一個(gè)長(zhǎng)度為2081 bp的片段。通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆序列與插入序列完全一致，證明Ad-SFRP5 shRNA載體構(gòu)建成功。

2.2 干擾載體病毒包裝

通過(guò)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的方法分別將pAV-shRNAEGFP和pAV-mSFRP5shRNA-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293A細(xì)胞中。2 d后，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。6 d后，周圍的細(xì)胞逐漸被感染，病毒開(kāi)始釋放，且感染面積越來(lái)越大。10 d后綠色熒光蛋白的面積進(jìn)一步增加。將收集到的原始病毒繼續(xù)感染HEK293A細(xì)胞，48 h后90%的地區(qū)都已被熒光蛋白覆蓋，表明細(xì)胞的形態(tài)開(kāi)始發(fā)生變化，開(kāi)始變大，變圓。

2.3 干擾載體感染3T3-L1細(xì)胞系

3T3-L1細(xì)胞被病毒感染。48 h后，感染的3T3-L1細(xì)胞在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色熒光，并且80%以上均被感染，證明Ad-SFRP5 shRNA重組腺病毒可感染細(xì)胞系。

3 討論與結(jié)論

脂肪因子是調(diào)節(jié)機(jī)體功能的重要因子，在機(jī)體內(nèi)有著不可替代作用。脂肪因子的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致肥胖，動(dòng)脈粥樣化等疾病的發(fā)生。肥胖是由于生活方式的轉(zhuǎn)變和飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變所引起的結(jié)果，是由于體內(nèi)的脂肪細(xì)胞增殖分化，引起脂肪組織的沉積。肥胖所引起的相關(guān)疾病大多是一些炎癥性的疾病，會(huì)抑制某些激素的活性，機(jī)體內(nèi)的一些信號(hào)通路會(huì)抑制蛋白酶的活性，干擾脂肪細(xì)胞的分化，使白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉(zhuǎn)變。SFRP5基因在維持機(jī)體的生命活動(dòng)方面具有重要的作用，主要在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，在脂肪細(xì)胞的增殖分化方面具有重要的誘導(dǎo)作用。同時(shí)可以抑制炎癥因子的活性，抑制炎癥因子或使其不表達(dá)，改善代謝性疾病，對(duì)動(dòng)脈粥樣化、脂質(zhì)沉積等疾病的研究產(chǎn)生重要的影響，對(duì)疾病的治療具有重要意義[3]。本研究通過(guò)Pacl單酶切和測(cè)序鑒定，篩選獲得Ad-Scramble shRNA和Ad-SFRP5 shRNA陽(yáng)性克隆。通過(guò)HEK293A細(xì)胞包裝、病毒擴(kuò)繁、腺病毒感染效率測(cè)定等，成功取得了所需的病毒顆粒[4]。3T3-L1細(xì)胞系被獲取的病毒感染后，發(fā)現(xiàn)其感染效率可達(dá)80%以上。此次結(jié)果表明載體構(gòu)建及病毒制備成功，為以后的試驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。