帕金森病大鼠黑質(zhì)致密部IgG蛋白的表達(dá)變化

汪明玉 劉志輝 付文玉 莊文欣 孫楊 楊同 王欣 劉宗昱 王曉曉 馬璐璐

帕金森病(PD)是中老年人常見(jiàn)的進(jìn)行性神經(jīng)元變性疾病，其典型的病理學(xué)特征是黑質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元大量變性和丟失。近年來(lái)，氧化應(yīng)激及免疫炎性反應(yīng)已成為PD發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究結(jié)果證明，在PD患者或PD動(dòng)物模型腦中均可發(fā)現(xiàn)包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)等在內(nèi)的多種炎性反應(yīng)因子表達(dá)水平增高[1]，推測(cè)這是導(dǎo)致DA神經(jīng)元變性凋亡的主要機(jī)制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外源性免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)可通過(guò)誘導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)成功建立PD的動(dòng)物及細(xì)胞模型，提示IgG參與了PD的發(fā)病過(guò)程[2]。更為引人注目的是，IgG已被證明可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元自主分泌，并廣泛存在于大腦皮質(zhì)、海馬、脊髓、小腦及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的脊神經(jīng)節(jié)等處[3-4]。但目前尚不清楚黑質(zhì)部位是否有IgG陽(yáng)性細(xì)胞存在，其分布特點(diǎn)如何，在PD發(fā)生中是否發(fā)生改變。該研究探討了PD模型大鼠黑質(zhì)致密部IgG的表達(dá)變化及其在PD發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物和試劑Spraque-Dawley(SD)健康雄性大鼠20只，體質(zhì)量(180～220)g，購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為模型組(15只)和健康對(duì)照組(5只)。6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿撲嗎啡(apomorphine，APO)及酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)小鼠多克隆抗體為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；兔抗大鼠IgG多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；SP試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品；ZH-藍(lán)星腦立體定位儀購(gòu)自淮北正華生物儀器器材公司；熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1模型制備：以水合氯醛(0.4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于腦立體定位儀上，常規(guī)消毒后沿正中線切開(kāi)顱頂皮膚，暴露前、后囟，參照Pellegrino等大鼠腦立體定位圖譜，采用兩點(diǎn)注射法制備大鼠PD模型[5]。右側(cè)黑質(zhì)坐標(biāo)系統(tǒng)為：前囟后5.0 mm，正中線右側(cè)2.0 mm，硬膜下8.0 mm；右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束坐標(biāo)系統(tǒng)：前囟后4.4 mm，正中線右側(cè)1.2 mm，硬膜下8.0 mm。用10 μL微量進(jìn)樣器注入6-OHDA (2 μg/μL)，每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)注射10 μL，注射速度為1 μL/min，注射完畢后留針10 min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。術(shù)后2周腹腔注射0.01%(質(zhì)量濃度)的APO(0.5 mL/kg)，觀察、記錄大鼠的行為變化，若頭尾相接恒定轉(zhuǎn)向健側(cè)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥210 r/30 min，則視為PD大鼠造模成功。選取造模成功的5只大鼠作為模型組。

1.2.2灌注取材及切片：將兩組大鼠麻醉后由頸總動(dòng)脈依次灌注生理鹽水50 mL及4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛200 mL，斷頭取腦，在4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中后固定過(guò)夜。取中腦部位組織，制備石蠟切片，片厚5 μm。

1.2.3免疫組化：取兩組大鼠的中腦黑質(zhì)部位相鄰切片，采用免疫組織化學(xué)ABC法分別進(jìn)行TH及IgG染色。步驟簡(jiǎn)述如下：切片脫蠟至水，入3%(體積分?jǐn)?shù)) H2O2溶液于37℃孵育15 min，正常羊血清封閉，37℃孵育30 min，傾去多余血清，加小鼠抗大鼠TH單克隆抗體(1∶1000)；相鄰切片加兔抗大鼠IgG多克隆抗體(1∶50)；4℃冰箱過(guò)夜。加生物素化二抗，37℃溫箱中l(wèi) h。加SABC工作液，37℃溫箱中l(wèi) h，DAB避光顯色。各步驟之間均用0.01 mol/L PBS沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每組大鼠選取6張切片，計(jì)數(shù)每張切片上損毀側(cè)和健側(cè)TH、IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并以損毀/健側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)之比表示陽(yáng)性表達(dá)的變化。另外，每只大鼠選取黑質(zhì)致密部，可見(jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞的相鄰切片5張，應(yīng)用Image-Pro Plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件，分別分析各組大鼠雙側(cè)黑質(zhì)部位TH、IgG的積分光密度(IOD)值，并以損毀側(cè)IOD值/健側(cè)IOD值之比表示陽(yáng)性表達(dá)的變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠行為學(xué)檢測(cè)15只大鼠有8只(53.3%)造模成功。注射APO后PD大鼠出現(xiàn)僵直狀態(tài)，隨后出現(xiàn)以健側(cè)后肢為支點(diǎn)的向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，呈首尾相接狀態(tài)，平均8～10圈/min。

2.2免疫組化光鏡下，對(duì)照組及模型組PD大鼠健側(cè)可見(jiàn)密集的、胞體較大的呈橢圓形或錐體狀的TH陽(yáng)性神經(jīng)元，有分支狀的軸突或樹(shù)突，TH免疫陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，TH陽(yáng)性纖維分支呈網(wǎng)狀，PD模型大鼠損毀側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，且細(xì)胞體積較小，突起變短，TH陽(yáng)性纖維稀疏；兩組大鼠黑質(zhì)致密部和網(wǎng)狀部IgG免疫陽(yáng)性細(xì)胞均有分布，細(xì)胞形狀呈錐體形或梭形，大小不等，對(duì)照組大鼠雙側(cè)黑質(zhì)致密部和模型組大鼠的健側(cè)IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，分布較稀疏，而模型組的損毀側(cè)IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，分布密集(圖1)。對(duì)照組大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)及其IOD值變化均高于PD模型組，而黑質(zhì)IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及其IOD值變化均低于PD模型組(表1)。

A：對(duì)照組大鼠黑質(zhì)致密部TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞體呈錐體形或橢圓形，細(xì)胞數(shù)量多，分布較密集；B：模型組大鼠黑質(zhì)致密部TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較少，分布較稀疏；C：對(duì)照組大鼠黑質(zhì)致密部IgG陽(yáng)性細(xì)胞胞體多呈梭形，數(shù)量較少，散在分布；D：模型組大鼠黑質(zhì)致密部IgG免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，分布較密集，體積較大

圖1光鏡下觀察兩組大鼠黑質(zhì)致密TH及IgG免疫陽(yáng)性神經(jīng)元變化(免疫組化，×200)

表 1 兩組大鼠黑質(zhì)致密部TH、IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化以及其IOD值變化比較

3 討論

許多證據(jù)表明，免疫/炎性反應(yīng)系統(tǒng)參與PD的發(fā)病，但關(guān)于IgG在神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)及其功能的研究較少。

TH是催化酪氨酸形成L-多巴的限速酶，是腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的特異性蛋白標(biāo)記物。該酶在黑質(zhì)紋狀體中活性和表達(dá)水平的變化與PD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD模型組損毀側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元分布稀疏、胞體輪廓及突起模糊，且同對(duì)照組相比TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目顯著降低，表明在PD模型鼠腦內(nèi)DA的合成能力明顯下降。

有研究報(bào)道，外源性單體IgG對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，但其機(jī)制尚不清楚，可能與IgG抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)局部神經(jīng)組織的損傷、減輕炎性反應(yīng)[6]或具有免疫調(diào)節(jié)作用[7]有關(guān)。而對(duì)內(nèi)源性(源自PD患者自身腦脊液及血清)IgG分子的研究發(fā)現(xiàn)，這些抗體能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的DA能神經(jīng)元(細(xì)胞株)變性，對(duì)DA能神經(jīng)元具有特異性損傷作用[8]。IgG可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，后者可以通過(guò)異常調(diào)理作用，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞呼吸爆發(fā)導(dǎo)致氧化應(yīng)激等作用引起DA能神經(jīng)元的相對(duì)特異性損傷[2]。另外，在補(bǔ)體存在的情況下，IgG可與小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而激活小膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生超氧化物及氧化亞氮等對(duì)DA能神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[9]。

近來(lái)有學(xué)者檢測(cè)分析PD患者血清中以往被認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和臨床表現(xiàn)有關(guān)的7種自身抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗神經(jīng)元抗體(antineuronal-cells)、抗腦裂解液抗體(anti-brain lysate)和抗dsDNA抗體(anti-dsDNA)顯著增高[10]，由此認(rèn)為這些自身抗體可以作為PD診斷的標(biāo)志物。由此可見(jiàn)，PD患者腦脊液和血清中的抗體在PD發(fā)病中具有重要的作用。

通過(guò)尸檢研究，使人們對(duì)PD患者腦組織中IgG與PD的關(guān)聯(lián)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。PD患者路易小體(Lewy body)呈IgG免疫反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，PD早期黑質(zhì)IgG陽(yáng)性神經(jīng)元比例顯著高于晚期，其比例與黑質(zhì)神經(jīng)元丟失程度呈負(fù)相關(guān)[11]。學(xué)者們認(rèn)為，神經(jīng)元結(jié)合IgG可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元死亡的一種共同反應(yīng)，是PD發(fā)病中體液免疫反應(yīng)引發(fā)選擇性黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性死亡發(fā)揮的作用。

雖然上述研究表明PD患者腦脊液、血清和腦組織中存在許多IgG分子，而且這些IgG分子與PD的發(fā)病和病理改變有關(guān)，但并未提到這些抗體的細(xì)胞來(lái)源。

IgG作為重要的免疫效應(yīng)分子，一直被認(rèn)為只由成熟B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，只有在血-腦脊液屏障(blood-brain barrier，BBB)受損時(shí)，IgG可以穿過(guò)BBB進(jìn)入腦內(nèi)參與免疫反應(yīng)。所以多年來(lái)學(xué)者們一直推測(cè)存神經(jīng)元中的IgG是從細(xì)胞外液中攝取而來(lái)。而在2008年Huang等研究發(fā)現(xiàn)，IgG存在于成年小鼠以及新生乳鼠的神經(jīng)元中，通過(guò)共聚焦顯微鏡可觀察到IgG免疫反應(yīng)產(chǎn)物位于神經(jīng)元的胞質(zhì)、軸突和樹(shù)突；通過(guò)原位雜交、單細(xì)胞RT-PCR方法進(jìn)一步研究顯示，重組免疫球蛋白γ鏈和κ鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也存在于成年小鼠腦神經(jīng)元中；采用35S和125I標(biāo)記的免疫沉淀反應(yīng)進(jìn)一步確定，小鼠腦神經(jīng)元可以產(chǎn)生IgG[3]。近年來(lái)有學(xué)者對(duì)產(chǎn)生IgG的細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦、小腦、海馬及脊髓等多種組織結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)及突起中IgG均有表達(dá)，神經(jīng)系統(tǒng)陽(yáng)性率可達(dá)82.3%，應(yīng)用原位雜交技術(shù)及RT-PCR技術(shù)從蛋白水平及mRNA水平進(jìn)一步明確了IgG既可以由神經(jīng)元自身產(chǎn)生并分泌[4]。在此將其稱(chēng)為神經(jīng)源性IgG。

該研究應(yīng)用腦內(nèi)注射神經(jīng)毒素6-OHDA成功制備大鼠PD模型，采用相鄰腦片，分別進(jìn)行TH和IgG免疫組化，染色結(jié)果可見(jiàn)，在正常大鼠黑質(zhì)致密部和網(wǎng)狀部均有IgG陽(yáng)性細(xì)胞存在，其陽(yáng)性細(xì)胞的大小、形態(tài)和分布情況與TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯不同：IgG陽(yáng)性細(xì)胞呈錐體形或梭形，細(xì)胞數(shù)量多，分布范圍明顯大于TH陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)域。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目顯著降低，而損毀側(cè)IgG陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增高，兩組TH和IgG陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值比值亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明神經(jīng)源性IgG的確參與了PD發(fā)病時(shí)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，大鼠黑質(zhì)致密部存在IgG陽(yáng)性細(xì)胞，而且PD大鼠黑質(zhì)IgG蛋白表達(dá)水平明顯增高，提示IgG參與了PD的發(fā)生。至于神經(jīng)源性IgG由黑質(zhì)致密部的何種細(xì)胞產(chǎn)生，在PD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有何種確切作用，還需做進(jìn)一步研究。

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