MARCH2簡(jiǎn)述

顏達(dá) 王暖 王浩坤 楊麗娟 劉成霞

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，濱州 256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤研究實(shí)驗(yàn)室，濱州 256600

蛋白質(zhì)的泛素化過程主要涉及3 種泛素化酶，分別是E1 泛素激活酶、E2 泛素結(jié)合酶和E3 泛素連接酶。人體內(nèi)有600 多種E3，但只有2 種E1 和約40 種E2，因此目前認(rèn)為E3 決定泛素化底物的特異性，被視為多種生理和病理進(jìn)程中的關(guān)鍵［1］。

MARCH（membrane-associated RING-CH fingerprotein）家族起源及結(jié)構(gòu)

MARCH 家族屬E3 泛素連接酶家族，由MARCH1～11 組成。該家族成員具有保守且顯著的結(jié)構(gòu)特征，即從N-到C-端，存在1個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING-CH）及數(shù)量不等的（0～14 個(gè)）跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）。MARCH 家族共享的RING（Really Interesting New Gene）結(jié)構(gòu)，分子量約為8 kDa，包含特征性間隔的半胱氨酸及組氨酸殘基，以交叉支撐的方式結(jié)合兩個(gè)鋅離子。其中RING 結(jié)構(gòu)域是MARCH 家族擁有E3 泛素連接酶活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，而跨膜結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)底物特異性識(shí)別［2］。

兩種主要的E3 泛素連接酶均分別包含HECT（homologous to E6AP C terminus）結(jié)構(gòu)域或者RING 結(jié)構(gòu)域。而RING結(jié)構(gòu)域?qū)儆阡\指模體類，擁有保守的半胱氨酸和組氨酸特異序列，因而據(jù)此分為RING-finger（C3HC4）、RING-H2-finger （C3H2C3） 、 LIM-finger （C2HC5） 和TRIAD-finger（C6HC）4 種類型。植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）或者白血病相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域（leukemia-associated protein domain，LAP）結(jié)構(gòu)層次上與RING-finger 相關(guān)，其結(jié)構(gòu)序列特征是C4HC3。在γ-2 皰疹病毒和痘病毒以及小部分真核基因組中，發(fā)現(xiàn)了PHD/LAP結(jié)構(gòu)域的亞家族，并命名為BKS結(jié)構(gòu)域。酵母菌中SSM4或者DOA10蛋白含有該模體，SSM4負(fù)責(zé)蛋白酶體對(duì)疏水蛋白一個(gè)亞類的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）進(jìn)行降解。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，該蛋白的BKS 結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步作為泛素化連接酶發(fā)揮作用。由于在序列及功能上與RING 和RING-H2 結(jié)構(gòu)域有相似性，所以它被提議命名為PHD/LAP模 體的BKS 亞 型，即RING-CH［3］。RING 結(jié)構(gòu) 域最 早 由Freemont發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，F(xiàn)reemont將其研究重點(diǎn)放在了一種富含半胱氨酸的序列，因?yàn)樵撔蛄斜徽J(rèn)為在那些與DNA 相互作用的蛋白中較為常見，所以含有該結(jié)構(gòu)的蛋白或許擁有與DNA相互作用蛋白類似的功能［4-5］。

在卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）基因組中的兩種RING-CH 蛋白K3 和K5，和γ-2 皰疹病毒68（MHV68）的單個(gè)K3 基因，其蛋白翻譯產(chǎn)物可以抑制細(xì)胞表面MHC-I 表達(dá)。此外，MHC-Ⅰ、KSHV-K5被發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)細(xì)胞表面共刺激分子ICAM-1 和B7.2 表達(dá)。并且黏液瘤病毒同系物M153R 通過與皰疹病毒蛋白相似的機(jī)制，作用于MHC-Ⅰ和CD4。因此，γ-2皰疹病毒和痘病毒屬共享同一個(gè)免疫逃逸蛋白家族，隨后該家族被命名為免疫識(shí)別調(diào)節(jié)因子（modulators of immune recognition，MIR）、Scrapins 或 者K3家族［3］。

由于痘病毒屬和皰疹病毒是不相關(guān)的病毒家族，因此病毒RING-CH 蛋白可能起源于真核宿主。目前已經(jīng)存在幾個(gè)皰疹病毒和痘病毒之間共享宿主相關(guān)免疫逃逸基因的例子。此外，在完成KSV基因組對(duì)應(yīng)區(qū)域序列后，有研究發(fā)現(xiàn)在低等真核生物基因組中存在KSHV-K3 和K5 的基因同源物等［6］。隨后幾名研究人員更進(jìn)一步描述了與病毒K3 家族相關(guān)的哺乳動(dòng)物K3 相關(guān)基因。這些同源物之一被命名為c-MIR，并且發(fā)現(xiàn)具有和KSHV-K5 非常相似的方式下調(diào)B7.2 的作用。與病毒K3 家族形成對(duì)比的是，c-MIR 不能減少M(fèi)HC-I的表面表達(dá)。包括c-MIR 在內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了8種其他與病毒蛋白相關(guān)的RING-CH 蛋白，隨后該家族被命名為MARCH［3］。

MARCH2的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)

編碼人類MARCH2 蛋白的基因由Bartee 課題組在2004年發(fā)現(xiàn)，并確定其定位于人類第19號(hào)染色體短臂13區(qū)2 帶（19p13.2），基因全長(zhǎng)25 746 bp，其開放讀碼框編碼246 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為2.6×104。并簡(jiǎn)單描述了MRCH2 的結(jié)構(gòu)及分布，MARCH2 是二次跨膜蛋白，由1 個(gè)N-端RING結(jié)構(gòu)域、2個(gè)二次跨膜區(qū)、2個(gè)雙亮氨酸模體（LL）和1 個(gè)C-端的PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成［3，7］，其中PDZ 結(jié)合模體對(duì)于MARCH2在細(xì)胞中的定位發(fā)揮著重要作用［8］。

MARCH2表達(dá)、定位及主要功能

MARCH2 廣泛表達(dá)于人體各組織，亞細(xì)胞定位包括核內(nèi)體膜、溶酶體膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及質(zhì)膜［3，8］，但根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果，MARCH2 在細(xì)胞膜上并沒有分布。目前其已知的MARCH2蛋白靶點(diǎn)有囊性纖維跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、STX-6、DLG1、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）、CD86（B7-2）以及β2-AR 等［9-10］。其主要作用包括：（1）可介導(dǎo)TfR 和CD86 的泛素化，并促進(jìn)其隨后的內(nèi)吞作用和通過多泡體分選到溶酶體；（2）接受來自E2 泛素結(jié)合酶的泛素，然后將泛素直接轉(zhuǎn)移到目標(biāo)底物上；（3）可能通過與STX-6的相互作用參與核內(nèi)體運(yùn)輸［8，11-12］。

1、MARCH2與CFTR

CFTR 是一種上皮細(xì)胞中的離子通道蛋白，在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞中水和離子的運(yùn)輸以及體液穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［13］，還介導(dǎo)跨細(xì)胞膜的氯離子運(yùn)輸［14］；在氣管中有助于調(diào)節(jié)氣道表面流體層的pH 值和離子含量，從而發(fā)揮防御病原體的作用［15］；還可調(diào)節(jié)其他離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性［16］。因此當(dāng)CFTR 缺失時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列病理狀況，例如囊性纖維化［9］。夏丹等［17］的研究首次證實(shí)了MARCH2能夠通過促進(jìn)CFTR 泛素化修飾及降解從而調(diào)控細(xì)胞自噬。在通過RINAi 技術(shù)抑制MARCH2 表達(dá)水平后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自噬效應(yīng)增強(qiáng)，并產(chǎn)生了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯。

在Cheng 和Guggino［9］的研究中，MARCH2 能誘導(dǎo)CFTR在溶酶體中的降解，該效應(yīng)與CFTR 相關(guān)配體（CAL）及STX-6有關(guān)。

Xia 等［18］后 續(xù) 研 究 發(fā) 現(xiàn)，在 結(jié) 直 腸 癌 細(xì) 胞 中MARCH2 可以通過促進(jìn)CFTR 泛素化及降解，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。并通過該研究首次證實(shí)了MARCH2可以在結(jié)直腸癌細(xì)胞中負(fù)向抑制基礎(chǔ)或應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。他們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MARCH2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的調(diào)控，是通過PIK3CA-AKT-MTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。并且揭示了在MARCH2 和CFTR 的反應(yīng)中，MARCH2 中的功能性PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不可或缺的部分。但該結(jié)論與Cheng 和Guggino［9］的研究結(jié)論相反，他們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)缺乏PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MARCH2 依然可以有效促進(jìn)CFTR 的泛素化和降解，因此認(rèn)為MARCH2 的PDZ 結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑FTR降解是非必需的。

2、MARCH2和STX-6

細(xì)胞囊泡之間對(duì)接和融合的調(diào)控由可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide - sensitive factor attachment protein receptors，SNAREs）介導(dǎo)，需要轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡和目標(biāo)囊泡膜表面的同源SNAREs 形成復(fù)合體，將兩個(gè)膜并置在一起，膜融合過程才能發(fā)生。STX-6是一種廣泛表達(dá)的SNAREs，定位在反式高爾基體網(wǎng)與核內(nèi)體，在體內(nèi)STX-6需要形成SNAREs復(fù)合體才能發(fā)揮作用，但該復(fù)合體的形成還需要STX 結(jié)合蛋白即MARCH2的參與［3］。

MARCH2 過表達(dá)可以導(dǎo)致STX-6 的重新分布［2，8］，并且MARCH2通過與STX-6結(jié)合作為核內(nèi)體和反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)之間的運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子［8］。在Nakamura 等［8］的研究中，發(fā)現(xiàn)MARCH2 在大鼠組織中廣泛表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)其亞細(xì)胞定位于核內(nèi)體膜和質(zhì)膜。通過免疫共沉淀和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，MARCH2 和STX-6 的C-端直接進(jìn)行了特異性結(jié)合。在對(duì)MARCH2過表達(dá)后，觀察到：STX-6以及與STX-6相互作用的SNAREs 重新分布到了MARCH2 陽性的囊泡中；影響了TGN38 和成對(duì)堿性氨基酸蛋白嵌合體到TGN 的運(yùn)輸，但不影響內(nèi)吞降解途徑與生物合成分泌途徑（與STX-6 跨膜區(qū)缺失突變產(chǎn)生的結(jié)果類似）；顯著降低了細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）的表達(dá)，影響了Tf 的攝取，干擾了Tf 到細(xì)胞核周圍循環(huán)內(nèi)體的運(yùn)輸過程。在通過RNAi 技術(shù)敲低MARCH2后，發(fā)現(xiàn)TGN38/46和STX-6在TGN上的定位受到了干擾。這些現(xiàn)象表明，MARCH2 可能作為核內(nèi)體與TGN之間的運(yùn)輸調(diào)節(jié)因子［8］。該研究雖然證明MARCH2參與了核內(nèi)體與高爾基體網(wǎng)絡(luò)之間的囊泡運(yùn)輸，但是無法回答MARCH2 是否參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體網(wǎng)絡(luò)之間分泌蛋白運(yùn)輸。

3、MARCH2和DLG1

DLG1屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶的分子支架蛋白家族，是正常發(fā)育所需要的多結(jié)構(gòu)域支架蛋白，含有多個(gè)PDZ 結(jié)構(gòu)域，可以將通道、受體及信號(hào)分子募集到極化細(xì)胞的離散細(xì)胞膜區(qū)域，還可能在黏附連接組裝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、遷徙、細(xì)胞結(jié)構(gòu)可塑性、突觸發(fā)生和淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮作用［19-27］。據(jù)報(bào)道，含有PDZ 結(jié)構(gòu)的分子支架在組織突觸連接中發(fā)揮著核心作用，分子支架的泛素化以及核內(nèi)體運(yùn)輸對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞連接與細(xì)胞極性的發(fā)生、維持具有重要意義［28］。

在Cao 等［28］的研究中，證明了DLG1 在表皮細(xì)胞中和MARCH2 共定于在細(xì)胞間接觸部位的錨點(diǎn)，并且MARCH2 能以一種PDZ 結(jié)構(gòu)域依賴的方式促進(jìn)DLG1 的泛素化。當(dāng)MARCH2 中的PDZ 結(jié)合模體缺失或者突變后，DLG1 與MARCH2 的共定位關(guān)系隨之消失，并且MARCH2 的分布發(fā)生極化。這些發(fā)現(xiàn)表明MARCH2 可能作為具有泛素連接酶催化活性的分子橋梁，聯(lián)系著內(nèi)吞腫瘤抑制因子蛋白（例如STX）與支架蛋白的PDZ 結(jié)構(gòu)域極性的確定。MARCH2中的PDZ配體模體參與了PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白DLG1 的識(shí)別和結(jié)合過程。但是MARCH2 是否被其他PDZ 結(jié)構(gòu)域蛋白例如NHERF1 和NHERF2 募集仍處于未知［29］。

Xia［30］研究發(fā)現(xiàn)，在人類食管癌中，MARCH2和DLG1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且MARCH2 表達(dá)增加更多出現(xiàn)在直徑更大、不良分化、浸潤(rùn)更深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更高TNM 分期的組織中。同時(shí)DLG1 的表達(dá)趨勢(shì)則恰好相反。說明MARCH2 的高表達(dá)及DLG1 的低表達(dá)共同參與了食管癌的發(fā)生與進(jìn)展。

4、MARCH2和TfR

TfR 主要功能是以非鐵依賴性方式介導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的細(xì)胞攝取，還參與鐵代謝、肝細(xì)胞功能和紅細(xì)胞分化，具有兩種亞型：TfR1 和TfR2［31］。MARCH2 能夠降低TfR 在細(xì)胞表面的表達(dá)最初由Bartee 等［3］發(fā)現(xiàn)。有研究表明，MARCH2 過表達(dá)后能干擾TfR 在細(xì)胞表面的表達(dá)［7］。在COS7 細(xì)胞中，大部分細(xì)胞內(nèi)的TfR 在MARCH2 過表達(dá)后重新定位到了MARCH2 陽性的囊泡中，并且MARCH2 過表達(dá)可以顯著降低細(xì)胞表面的TfR。TfR 在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用從而被目的細(xì)胞吸收，然后通過早期/循環(huán)核內(nèi)體返回細(xì)胞表面。并且證明了MARCH2 過表達(dá)可以阻礙TfR 到循環(huán)核內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)。與此同時(shí)，研究人員還觀測(cè)到Tf 攝取下降，并且排除了Tf 攝取減少是因?yàn)镸ARCH2 本身對(duì)內(nèi)吞途徑抑制導(dǎo)致，因此Tf 攝取抑制很可能是因?yàn)門fR在細(xì)胞表面降低的直接結(jié)果。

5、MARCH2與CD86

CD86是抗原提呈細(xì)胞（antigen-presentingcells，APC）表面的一種共刺激分子，CD86 與T 細(xì)胞表面的共刺激分子CD28 結(jié)合，從而為T 細(xì)胞提供共刺激信號(hào)并使得T 細(xì)胞易于激活［32］。CD86 主要表達(dá)于活化的B 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，通過結(jié)合CD28 或者細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞蛋白（cytotoxic T-lymphocyte protein 4，CTLA-4），參與T淋巴細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素-2 的產(chǎn)生；還參與調(diào)節(jié)B 細(xì)胞功能，起調(diào)節(jié)IgG 水平的作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD86 的泛素化是調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）抗原提呈的關(guān)鍵機(jī)制［33］。

在Baravalle 等［33］研 究 中，發(fā) 現(xiàn)MARCH1 可 以 促 進(jìn)CD86 的泛素化，并且這種泛素化在CD86 的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。在該研究中證實(shí)了MARCH1 通過促進(jìn)CD86 的泛素化從而下調(diào)CD86在樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了還有MARCH2 和MARCH8 也能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞中CD86 的泛素化。

6、MARCH2與β2-AR

在慢性心力衰竭中，β2-AR 被兒茶酚胺類刺激后產(chǎn)生一系列生理反應(yīng)，包括心肌細(xì)胞凋亡和肥大。與之相對(duì)的是，β2-AR 阻斷劑有益于慢性心力衰竭患者的生存收益。血管平滑肌中β2-AR 和α1-AR 與配體結(jié)合通過調(diào)節(jié)血管緊張度參與器官血流分配，從而保證了體內(nèi)重要器官的血液供應(yīng)。面對(duì)壓力或者運(yùn)動(dòng)時(shí)，心肌細(xì)胞β2-AR 的激活介導(dǎo)了心率增快和心肌收縮力增強(qiáng)［34］。

泛素化對(duì)于β2-ARs 到溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)過程及降解是必須的，并且β2-AR 在溶酶體中的泛素化降解是針對(duì)持續(xù)性的激動(dòng)劑刺激進(jìn)行脫敏反應(yīng)的主要機(jī)制［34-35］。該研究通過蛋白組學(xué)證明MARCH2 參與了卡維地洛激動(dòng)后β2-ARs 的泛素化修飾及降解，并且激活的β2-AR 的早期內(nèi)吞及內(nèi)吞后溶酶體分選過程是依賴于MARCH2 實(shí)現(xiàn)的。針對(duì)MARCH2 的這一特性，可以此為基礎(chǔ)開發(fā)新的針對(duì)慢性心力衰竭的治療藥物。

7、MARCH2和ERGIC3

除了上述靶點(diǎn)外，MARCH2 還可通過其他機(jī)制發(fā)揮其生理作用調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。針對(duì)前文提到了MARCH2是否參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體間的分泌蛋白運(yùn)輸，Yoo 等［36］給出了回答。通過生物素標(biāo)志法鑒定出了高爾基體中間區(qū)室蛋白3（ER-Golgi intermediate compartment protein 3，ERGIC3）作為MARCH2 的底物，并且闡明了MARCH2 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的分泌蛋白運(yùn)輸是通過促進(jìn)ERGIC3 的泛素化和降解實(shí)現(xiàn)的。并且MARCH2 和ERGIC3 的相互作用依賴于ERGIC3中的第6位和第8位賴氨酸。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在敲除ERGIC3 后，α1-抗胰蛋白酶和結(jié)合珠蛋白的分泌受到了阻礙。并且MARCH2 的過表達(dá)也可以降低α1-抗胰蛋白酶和結(jié)合珠蛋白的分泌，與此同時(shí)具有抗泛素化能力的突變ERGIC3 可以部分抵抗敲低MARCH2 帶來的影響。從而證明了MARCH2 同過催化ERGIC3 的泛素化和降解，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體之間的分泌蛋白的運(yùn)輸。

除此之外，MARCH2 還參與人類免疫缺陷病毒的抑制［37-38］，以及非洲蟾蜍頭部的形成［39］，并且在太平洋牡蠣中參與脂多糖免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)［40］。

討 論

MARCH2 廣泛表達(dá)于人體各組織，且主要定位于核內(nèi)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等質(zhì)膜。由于擁有E3 泛素連接酶活性，MARCH2 通過泛素化其底物，促進(jìn)底物分選、運(yùn)輸及降解，從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的目的。目前對(duì)MARCH2在細(xì)胞內(nèi)的認(rèn)知主要通過其PDZ結(jié)合模體與PDZ結(jié)合蛋白發(fā)生作用從而參與胞質(zhì)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，繼而調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，并且部分研究發(fā)現(xiàn)MARCH2和消化道腫瘤之間還存在一定的關(guān)聯(lián)性。與此同時(shí)，根據(jù)對(duì)RING 結(jié)構(gòu)域蛋白的研究結(jié)果，含有RING結(jié)構(gòu)域的蛋白很有可能能夠和DNA相互作用［5］，因此除以上提到的作用及效應(yīng)外，MARCH2 還具有與DNA 相互作用的可能性，但目前尚未見報(bào)道。由于MARCH2 在結(jié)直腸癌和食管癌中均具有病理意義，因此可將MARCH2 作為靶點(diǎn)開發(fā)針對(duì)消化道腫瘤的新藥物或新方案。